A Dengue é uma doença que atinge milhões de pessoas em todo o mundo, e pode levar à morte. O Brasil é o país que apresenta o maior número de casos combinados de Dengue e febre hemorrágica da Dengue (D/FHD). No entanto, não existem medicamentos específicos para o tratamento de D/FHD e, uma vez infectado, as recomendações da OMS estão limitadas à observação e tratamento sintomático. Esforços recentes têm revelado uma série de proteínas essenciais para o ciclo de vida do vírus do Dengue, que podem ser utilizados como alvos para novos medicamentos. O objetivo deste estudo é entender o mecanismo de ação de uma dessas enzimas, a proteína não estrutural NS3 protease complexada com o seu cofator NS2B (NS2B-NS3), responsável pela clivagem da poliproteína viral durante a etapa de replicação do vírus, e a compreensão da interação desta proteína com um inibidor e dois modelos do substrato através de estudos de dinâmica molecular. Aqui usamos DM-QM/MM e Umbrella Sampling para estudar o primeiro passo (acilação) da reação catalisada pela NS2B-NS3, usando o método semi-empírico PDDG/PM3 para o subsistema QM, e o campo de força Amber FF99SB para o subsistema MM. É necessária a construção de um modelo estrutural que represente a NS2B-NS3 protease na forma ativa (fechada), chamada DENF2f, e o estudo do comportamento dos sistemas por dinâmica molecular da estrutura NS2B-NS3 inativa (aberta), DENV2a, assim como o modelo de estrutura ativa na presença de um inibidor, e também com dois modelos diferentes de substrato, a fim de conhecer as peculiaridades de cada sistema e validar o modelo estrutural da NS2B-NS3 protease ativo do vírus da Dengue. Os resultados revelam que a protease NS2B-NS3 pode existir também na conformação fechada em solução, mesmo na ausência do inibidor. O DENV2f revelou-se um modelo realístico para o estudo de modelagem para triagem de inibidores, assim como para o estudo do mecanismo de reação durante a replicação viral. Com relação ao mecanismo de reação, nossos resultados indicam que o ataque nucleofílico da SER117 sobre o substrato ocorre gradualmente, em que uma transferência de próton para a HIS33 primeiro ativa a SER117, que só depois ataca o substrato. O passo determinante para velocidade de reação é a ativação da SER117, com uma barreira de 24,1 kcal/mol. A cavidade oxiânion é formada por moléculas de água que estabilizam a carga negativa formada sobre o oxigênio carboxílico do substrato. O passo final da reação é a transferência do próton da HIS33 ao nitrogênio do substrato, o que acontece com uma barreira de ativação mais baixa de 5,1 kcal/mol, e induz diretamente a quebra da ligação peptídica.CAPESDengue is a vector tropical disease affecting millions of people, and may lead to death. Brazil is the country with the highest number of Dengue and Dengue hemorrhagic fever (D/DHF) cases combined. However, there are no specific medicines for the treatment of D/DHF and, once infected, the WHO recommendations are limited to observation and symptomatic treatment. Recent efforts have revealed a series of proteins essential to the Dengue virus’s life cycle, which may be used as targets for new medicines. The objective of this study is to understand the mechanism of action of such an enzyme, the nonstructural protein NS3 protease complexed with the cofactor NS2B (NS2B-NS3), responsible for cleaving the viral polyprotein during the virus replication step, and understanding this protein’s interaction with its substrate and inhibitor through molecular dynamics studies. For the reaction study, a preparation is needed that includes the construction of a model for the protease structure in active (closed) form, named DENF2f, and the study of the systems’ behavior by molecular dynamics of the NS2B-NS3 inactive structure (open), the model for active structure, and the model in the presence of an inhibitor or and two different models of the substrate, in order to know the peculiarities of each system and validate the structural model of the active NS2B-NS3 Dengue virus protease. Here we used QM/MM-MD and Umbrella Smapling to study the first step (acylation) of the reaction catalyzed by NS2B-NS3pro, using the PDDG/PM3 semi-empirical Hamiltonian for the QM subsystem, and Amber FF99SB for the MM subsystem. The results show that the NS2B-NS3 protease may also exist in a closed conformation in solution, even in the absence of inhibitor. The DENV2f proved to be a realistic model for a modeling study for screening for inhibitors as well as for the study of the reaction mechanism during viral replication. Our results indicate that the nucleophilic attack on the substrate by SER117 occurs in a stepwise manner, where a proton transfer to HIS33 first activates SER117, which only later attacks the substrate. The rate-determining step is the SER117 activation, with a barrier of 24.1 kcal/mol. Water molecules completing the oxyanion hole stabilize the negative charge formed on the carbonyl oxygen of the substrate. The final step in the process is a proton transfer from HIS33 to the substrate’s nitrogen, which happens with a lower barrier of 5.1 kcal/mol, and leads directly to the peptide bond breaking.