doctoralThesis
Preparação e caracterização de nanocápsulas peptídicas destinadas à veiculação de compostos terapêuticos
Autor
BARROS, Sheila de Melo
Institución
Resumen
Cápsulas peptídicas anfifílicas ramificadas ou do inglês, “Branched Amphiphilic Peptide Capsules” (BAPCs), são nanocápsulas formadas pela organização de dois peptídeos de diferentes tamanhos (Ac-FLIVI)₂-K-K₄-CO-NH₂ e (Ac-FLIVIGSII)₂-K-K₄-CO-NH₂ capazes de encapsular um grande número de diferentes moléculas. O atual trabalho teve como ponto de partida um estudo no campo do estado da arte, comparando e contrastando os diferentes nanocarreadores de última geração com os estudos até então publicados sobre as BAPCs, resultando na publicação: “A review of solute encapsulating nanoparticles used as delivery systems with emphasis on branched amphipathic peptide capsules”, DOI: 10.1016/j.abb.2016.02.027. Posteriormente, a pesquisa se voltou para a caracterização das BAPCs a partir da variação das proporções de seus peptídeos constituintes (1:0, 0.8:0.2, 0.5:0.5, 0.2:0.8 e 0:1) no intuito de avaliar a viabilidade de formação das nanocápsulas e suas propriedades físico-químicas características. Os testes de encapsulamento realizados por supressão de fluorescência do corante eosina Y revelaram a formação das cápsulas em todas as proporções utilizadas e que as mesmas permanecem estáveis na faixa de temperatura de 4 °C - 95 °C, ao mesmo tempo em que as BAPCs preparadas a 4 °C evidenciaram uma maior eficiência de encapsulamento quando comparadas àquelas preparadas a 25 °C e 37 °C. A análise da estrutura secundária por dicroísmo circular (DC) mostrou que os peptídeos em diferentes proporções resultam em cápsulas com estruturas secundárias características, indicando que (FLIVI)₂-K-K₄ é responsável pela conformação aleatória, enquanto que (FLIVIGSII)₂-K-K₄ mostra ser responsável pelos arranjos em folha beta. Paralelamente, os tamanhos determinados por espalhamento de luz dinâmico (DLS) revelaram a formação de BAPCs com um valor médio de 10 - 45 nm de diâmetro. Já os dados de voltametria (VC) cíclica sugerem que as BAPCs formadas por (FLIVIGSII)₂-K-K₄ apresentam a bicamada de menor espessura. Esta mesma sequência mostrou ainda o menor valor de citotoxicidade nos testes de citometria de fluxo (CF) e a maior taxa de transfecção quando utilizadas na entrega de um plasmídeo de 4.7 kb usado para a expressão de EGFP in vitro. Tais resultados destacam a habilidade de formar cápsulas estáveis de tamanhos desejados e estruturas variadas tornando as BAPCs atraentes candidatas para o transporte de ácidos nucleicos e potencialmente úteis para a entrega de compostos farmacológicos. Os resultados foram publicados por meio do artigo: “Branched amphipathic peptide capsules: different ratios of the two constituent peptides direct distinct bilayer structures, sizes, and DNA transfection efficiency”, DOI: 10.1021/acs.langmuir.7b00912. CAPES Branched Amphipathic Peptide Capsules (BAPCs) are nano-capsules formed from the spontaneous assembly of two different sized peptides (Ac-FLIVI)₂-K-K₄-CO-NH₂ e (Ac-FLIVIGSII)₂-K-K₄-CO-NH₂ able to encapsulate different solute molecules. This work initially focused on comparing and contrasting different state of the art nano-carriers with an emphasis on earlier BAPCs studies. This resulted in a publication: “A review of solute encapsulating nanoparticles used as delivery systems with emphasis on branched amphipathic peptide capsules”, DOI: 10.1016/j.abb.2016.02.027. Subsequently, the research focused on BAPCs characterization studies varying the ratios of the two peptides (1:0, 0.8:0.2, 0.5:0.5, 0.2:0.8, and 0:1) aiming to evaluate the viability of the capsules formation and their physical-chemical properties. The encapsulation efficiency tests using the self-quenching fluorescent dye eosin Y revealed all the ratios produced capsules that remain thermally stable in a range of 4°C - 95 °C, at the same time that the 4 °C showed the highest encapsulation efficiency when compared to the ones prepared at 25 °C and 37 °C. The secondary structures analyses made by circular dichroism (CD) showed that the different peptide ratios produce capsules with specific secondary structures indicating that the (FLIVI)₂-K-K₄ is responsible to lead the random coil conformation, while the (FLIVIGSII)₂-K-K₄ seems to be responsible for the beta-sheet arranges. In parallel, the sizes were determined by dynamic light scattering (DLS) and revealed that the different ratios yielded BAPCs that varied in size ranging from 10 - 45 nm in diameter. In addition, results obtained using Cyclic Voltammetry (CV) revealed that BAPCs formed from just (FLIVIGSII)₂-K-K₄ have the thinnest bilayer. The same sequence also displayed the lowest cytotoxicity at the Flow Cytometry (FC) analyses and the highest transfection efficiency when used to deliver a plasmid of a 4.7 kb responsible for the expression of EGFP in vitro. These results highlight the ability to prepare stable capsules of desired sizes and varied structures making the BAPCs currently attractive as a delivery vehicle for nucleic acids and encapsulated pharmacological compounds. The results were published: “Branched amphipathic peptide capsules: different ratios of the two constituent peptides direct distinct bilayer structures, sizes, and DNA transfection efficiency”, DOI: 10.1021/acs.langmuir.7b00912.