Caracterização estrutural e expressão diferencial de defensinas e TLPS (Thaumatin-Like Proteins) em Vitis spp. sob estresse biótico

dc.contributorBENKO-ISEPPON, Ana Maria
dc.contributorSILVA, Roberta Lane de Oliveira
dc.contributorMELO, Natoniel Franklin de
dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/5396976695153422
dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/7796654028353519
dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/7828922963260239
dc.contributorhttp://lattes.cnpq.br/0592333655980257
dc.creatorOLIVEIRA, Marianne Firmino de
dc.date2019-11-20T19:08:37Z
dc.date2019-11-20T19:08:37Z
dc.date2019-03-21
dc.date.accessioned2022-10-06T15:11:49Z
dc.date.available2022-10-06T15:11:49Z
dc.identifierOLIVEIRA, Marianne Firmino de. Caracterização estrutural e expressão diferencial de defensinas e TLPS (Thaumatin-Like Proteins) em Vitis spp. sob estresse biótico. 2019. Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas) – Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 2019.
dc.identifierhttps://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/35315
dc.identifier.urihttp://repositorioslatinoamericanos.uchile.cl/handle/2250/3978753
dc.descriptionA videira (Vitis vinifera) possui grande representatividade na economia mundial. No entanto, esta espécie vem sofrendo com a influência de condições ambientais adversas, especialmente pelo ataque de patógenos, impactando sobre a produtividade da cultura. Dessa forma, estudos baseados nos mecanismos de defesa têm sido propostos visando o estabelecimento de estratégias aplicáveis ao melhoramento e à biotecnologia, para minimizar os danos causados por patógenos. O presente trabalho objetivou analisar a estrutura de genes codificantes de peptídeos antimicrobianos (AMPs) do tipo defensina e TLP (Thaumatin Like Protein) em Vitis spp., inferindo sobre seus padrões de expressão, características estruturais e funcionais. Para tanto, foram geradas bibliotecas de RNA-Seq (Illumina HiSeq2500) usando clones da cultivar ‘Red Globe’ (considerada susceptível ao cancro bacteriano) e do híbrido IAC-572, resultante do cruzamento entre o porta-enxerto 101-14 MGT (V. riparia X V. rupestres) com V. caribaea. O híbrido resultante é considerado apenas moderadamente resistente ao cancro bacteriano. As coletas foram realizadas em quatro tempos distintos: 90 minutos, 6 horas, 24 horas e 48 horas após a inoculação com a bactéria Xanthomonas citri pv. anacardi (Xca). Para as análises in silico, sequências-sonda das duas classes de AMPs foram retiradas do banco de dados CAMP e submetidas à ferramenta HMMER, utilizada para identificar padrões de AMPs de interesse. As análises via HMMER permitiram a identificação de duas defensinas e de 32 TLPs. A predição da atividade antimicrobiana in silico indicou que as sequências possuem alto potencial antimicrobiano. A modelagem molecular por homologia possibilitou o desenho de modelos tridimensionais para cada AMP avaliado, com os candidatos apresentando 90 % dos resíduos de aminoácidos em regiões energeticamente favoráveis. Após caracterização e modelagem comparativa, foram desenhados 11 pares de primers, sendo cinco para transcritos que codificaram genes de defensina e seis para TLPs. Desse total, quatro pares de primers (VvDef2, VvTLP1, VvTLP3 e VvTLP4) demonstraram-se eficientes nas amostras de cDNA das duas cultivares de Vitis e foram selecionados para validação da expressão usando PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR). As análises de expressão relativa realizadas para VvDef2 e VvTLP3 confirmaram os resultados da expressão diferencial da RNA-Seq. Por sua vez, VvTLP1 e VvTLP4 apresentaram, na cultivar resistente, uma indução de 5,36 e 9,19 após 48 horas de inoculação com Xca em relação aos seus controles sob condições normais, enquanto na cultivar susceptível a sua expressão não foi alterada, ressaltando a resistência moderada do híbrido IAC 572 e a susceptibilidade acentuada da cultivar Red Globe. Os resultados permitiram obter dados relevantes quanto aos efeitos da interação patogênica entre a videira e Xca, além de caracterizar e validar AMPs promissores para uso em programas de melhoramento da cultura.
dc.descriptionCNPq
dc.descriptionThe vine (Vitis vinifera) has a great representation in the worldwide economy. However, this species has been suffering from the influence of adverse environmental conditions, especially by the attack of pathogens, impacting on the crop productivity. Thus, studies based on defense mechanisms have been proposed aiming to establish strategies for the biotechnological improvement to minimize the damage caused by pathogens. The present project aimed to analyze the structure of genes encoding antimicrobial peptides (AMPs) of the defensin type and TLP (Thaumatin Like Protein) in Vitis spp., Inferring on their expression patterns, structural and functional characteristics. To that end, RNA-Seq (Illumina HiSeq2500) libraries were generated using clones of the 'Red Globe' cultivar (susceptible to bacterial canker) and of the hybrid IAC-572, resulting from the crossing between the rootstock 101-14 MGT (V. riparia X V. rupestres) with V. caribaea. The hybrid is considered only moderately resistant to bacterial canker. The samples were collected in four different times: 90 minutes, 6 hours, 24 hours and 48 hours after inoculation with the bacterium Xanthomonas citri pv. anacardi (Xca). For the in silico analyzes, seed sequences of two classes of AMPs were retrieved from the CAMP database and submitted to the HMMER tool, used to identify the sequence pattern of the AMPs. The HMMER analysis allowed the identification of two defensins and 32 TLPs. The prediction of the in silico antimicrobial activity indicated that the sequences have a high antimicrobial potential. Homology molecular modeling enabled the elucidation of the protein structures, with candidates presenting 90% of the amino acid residues in energetically favorable regions. After the characterization and comparative modeling, 11 pairs of primers were designed, five for transcripts encoding defensin genes and six for TLPs. From this total, four pairs of primers (VvDef2, VvTLP1, VvTLP3 and VvTLP4) were efficient in the cDNA samples of the two Vitis cultivars and were selected for validation of expression using real-time quantitative PCR (RT-qPCR). The relative expression analysis performed for VvDef2 and VvTLP3 confirmed the differential expression of RNA-Seq. On the other hand, VvTLP1 and VvTLP4 presented an induction of 5.36 and 9.19 respectivelly in the resistant cultivar after 48 hours of inoculation with Xca in compared to their controls under normal conditions, whereas in the susceptible cultivar its expression it was not altered, emphasizing the moderate resistance of the hybrid IAC 572 and the high susceptibility of the cultivar Red Globe. The results allowed to obtain relevant data regarding the effects of the pathogen interaction between the grape and Xca, besides characterizing and validating promising AMPs for use in crop breeding programs.
dc.formatapplication/pdf
dc.languagepor
dc.publisherUniversidade Federal de Pernambuco
dc.publisherUFPE
dc.publisherBrasil
dc.publisherPrograma de Pos Graduacao em Ciencias Biologicas
dc.rightsopenAccess
dc.rightsAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil
dc.rightshttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/
dc.subjectVideira
dc.subjectXanthomonas citri pv
dc.subjectRNA
dc.titleCaracterização estrutural e expressão diferencial de defensinas e TLPS (Thaumatin-Like Proteins) em Vitis spp. sob estresse biótico
dc.typemasterThesis


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