Stigmurine is an antimicrobial peptide of pharmaceutical interest that has been gaining prominence for the production of new medicines. However, its a recently elucidated molecule and little has been reported in the literature about analytical methodologies aimed at its quality control. Thus, the aim of this paper is perform a study of the robustness of a method by Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) developed for the quantification of Stigmurine using box-behnken design (BBD) as design of experiments (DoE) and response surface analysis and desirability function as statistical tool for data analysis. The method proved to be robust for the quantification of stigmurin with Relative Standard Deviation (%DPR) < 2% for the response chromatographic peak area, however it was possible to observe that the %FMB factor influences the alteration of the system's suitability parameters (time of retention, resolution and tailing factor) more significantly than the other factors, but has little influence on the chromatographic peak area. The method under analysis had a predominantly desirable function (D) > 0.5 for the tested regions, and the regions that promote greater desirability are close to the highest value for %FMB and lowest values for temperature and flow, reaching up to a value of D > 0.7.stigmurina é um peptídeo antimicrobiano de interesse farmacêutico que vem ganhando destaque para a produção de novos medicamentos. Contudo, por ser uma molécula recém elucidada, pouco se tem relatado na literatura acerca de metodologias analíticas voltadas ao seu controle de qualidade. Assim, o objetivo deste trabalho foi realizar o estudo da robustez de um método por Cromatografia Líquida de Ultra Eficiência (UHPLC) desenvolvido para a quantificação da stigmurina utilizando box-behnken design (BBD) como desenho experimental (DoE) e análise de superfície de resposta e função de desejabilidade como ferramenta estatística para análise dos dados. O método se apresentou robusto para a quantificação da stigmurina com Desvio Padrão Relativo (%DPR) < 2% para a resposta área do pico cromatográfico, entretanto foi possível observar que o fator %FMB influencia a alteração dos parâmetros de adequabiliidade do sistema (tempo de retenção, resolução e fator de cauda) de maneira mais significativa em relação aos outros fatores, mas tem pouca influência sobre a área do pico cromatográfico. O método em análise apresentou função de desejabilidade predominantemente (D) > 0,5 para as regiões testadas, e as regiões que promovem maior desejabilidade se encontram próximas ao maior valor para %FMB e menores valores para temperatura e fluxo, atingindo até um valor de D > 0,7.