dc.description.abstract | A descoberta do DNA fetal livre de células na circulação materna viabilizou o
desenvolvimento de tecnologias para o diagnóstico pré-natal não invasivo. Neste trabalho
foram desenvolvidos três estudos independentes relacionados a este tema. O objetivo do
primeiro estudo foi determinar o haplótipo Y-STR do feto no plasma materno durante a
gravidez e estimar, de forma não invasiva, se o suposto pai e feto pertencem à mesma
linhagem masculina. O estudo incluiu casais com gravidez única e paternidade
supostamente conhecida. O sangue periférico foi coletado em tubos EDTA (mãe) e em papel
FTA (pai). O DNA do plasma materno foi extraído usando NucliSens EasyMAG (Biomerieux).
O sexo fetal foi determinado por qPCR pesquisando o alvo DYS-14 no plasma materno e
também foi confirmado após o parto. Dos voluntários incluídos, 20 mães com fetos
masculinos e 10 mães com fetos femininos foram selecionadas para a análise de Y-STR. A
moda da idade gestacional foi de 12 semanas. Todas as amostras de DNA foram
submetidas a amplificação por PCR com kits PowerPlex Y23, ampFLSTR Yfiler e dois
multiplexes próprios, que em conjunto representam 27 diferentes Y-STR. Os produtos de
PCR foram detectados no analisador genético 3500 e foram analisados usando o software
GeneMapper-IDX (Life Technologies). Os haplótipos fetais (formato Yfiler) foram
comparados com outros 5328 haplótipos brasileiros disponíveis no banco de dados de
referência de haplótipos cromossômicos Y (YHRD). Como resultado, entre 22 e 27 loci foram
amplificados com sucesso a partir do plasma materno em todos os 20 casos de fetos
masculinos. Nenhuma das mulheres com fetos femininos apresentou um haplótipo Y-STR
falsamente amplificado. O haplótipo detectado no plasma materno correspondeu ao
haplótipo do pai alegado em 16 dos 20 casos. Quatro casos apresentaram inconsistências
simples e que não configuravam exclusões; 1 caso mostrou uma mutação no locus DYS458
devido à contração de uma unidade repetição e 3 casos apresentaram “dropout” em um dos
locus DYS385 I/II. Todas as inconsistências foram 6 confirmadas após o nascimento do
bebê. Dezesseis haplótipos fetais não foram encontrados em YHRD e um deles apresentou
mutação, o que corresponde à probabilidade de paternidade de 99,9812% e 95,7028%,
respectivamente. Três haplótipos fetais ocorreram duas vezes no YHRD, o que corresponde
à probabilidade de paternidade de 99,9437%. Em conclusão, um haplótipo Y-STR fetal
discriminatório pode ser obtido da análise do plasma materno durante a gravidez a partir da
décima segunda semanas de gestação. Todos os fetos masculinos puderam ser atribuídos à
linhagem masculina do pai alegado no início da gravidez. A alta probabilidade de
paternidade associada a cada caso sugere que a relação não é aleatória e essa estratégia
pode ser usada como alternativa para análise de parentesco fetal masculino. Posteriormente
foi questionado se o DNA fetal estaria presente na microcirculação materna e se a
determinação não invasiva do sexo fetal utilizando o sangue capilar coletado por punção
digital é comparável aos resultados obtidos do plasma isolado do sangue venoso. Desta
forma, o segundo estudo envolveu 101 voluntárias grávidas. A mediana da idade gestacional
(min–max) foi 11 (8–20) semanas. Inicialmente o desenho experimental do estudo foi
prospectivo. No entanto, após iniciar os experimentos resultados falsos positivos para o DNA
masculino foram identificados nas amostras de sangue capilar usando um protocolo de
assepsia com álcool isopropílico. Suspeitou-se da contaminação da pele dos dedos
maternos com DNA exógeno masculino. Subsequentemente novos protocolos de assepsia
do local de coleta do sangue capilar (ponta dos dedos) foram implementados (hipoclorito de
sódio 0,5% tamponado aplicado duas vezes e hipoclorito de sódio 1% tamponado aplicado
uma vez). Os resultados obtidos do plasma isolado do sangue venoso e capilar foram
comparados com o sexo do recém-nascido ao nascimento. As análises revelaram que a
sensibilidade e especificidade da determinação do sexo fetal no sangue venoso comparado
ao sexo no nascimento foi 100% (95%IC 93- 100%) e 100% (95%IC 93-100%). No sangue
capilar, os resultados foram 100% (95%IC 78-100%) e 58% (95%IC 27-84%) para o grupo
do álcool isopropílico, 100% (95%IC 83-100%) e 100% (95%IC 82-100%) para o grupo do
hipoclorito de sódio tamponado à 0,5%, e 100% (95%IC 80-100%) e 100% (95%IC 81-100%)
para o grupo do hipoclorito de sódio tamponado à 1%, respectivamente. Em conclusão, o
DNA fetal está presente no sangue capilar materno permitindo a determinação não invasiva
do sexo fetal. O DNA masculino exógeno pode estar presente nas pontas dos dedos das
mulheres grávidas e ser detectável gerando resultados falsos positivos. Por isto, a
eliminação do DNA masculino exógeno é crítica para uma confiável determinação do sexo
fetal usando o sangue capilar materno. As soluções de hipoclorito de sódio diluído e
tamponado, entre 0,5% e 1% pode ser usado para eliminar o DNA masculino exógeno das
pontas dos dedos das mulheres grávidas. Por fim, o uso do cromossomo Y no diagnóstico
pré-natal não invasivo limita sua aplicação aos fetos masculinos. Portanto, seria importante o
desenvolvimento de tecnologias para análise do DNA fetal independentemente do sexo fetal
e que contemple os cromossomos autossômicos. Assim, hipotetizou-se usar os
polimorfismos de inserção e deleção (Indels) presentes no pai e ausentes na mãe como
“pequenas ilhas” de diferenças genéticas entre mãe e feto para o estudo pré-natal não
invasivo das características genéticas do feto. Entretanto, antes de desenvolver esta
metodologia seria necessário conhecer as frequências alélicas e os parâmetros forenses
destes Indels usando um conjunto de marcadores que tenha sido previamente validado e de
preferência na população local. O tema de pesquisa do terceiro estudo foi avaliar as
frequências alélicas de 38 indels na população do Distrito Federal. Os resultados indicam
que este conjunto é um sistema genético altamente informativo, pois a probabilidade de
discriminar dois indivíduos selecionados ao acaso é de 99,9999999999993% e a
probabilidade de excluir um indivíduo falsamente acusado em um caso de paternidade é
99,81%. Com base nas frequências alélicas foram calculadas as distâncias genéticas da
população estudada (Distrito Federal) em relação as populações descritas em outros
estudos (Portugal, África, Ásia, tribo Terena e do estado do Rio de Janeiro). A análise das
distâncias genéticas entre as diferentes populações revelou que o Distrito Federal é mais
semelhante ao Rio de Janeiro, assumindo uma posição intermediária em relação à Europa e
Rio de Janeiro - Afrodescendente e foi distante dos nativos americanos, africanos e do leste
asiático. Esta conclusão está de acordo com a composição da população relatada no Censo
2010, em que a maioria dos imigrantes era do Nordeste e do Sudeste. Estes três estudos
foram aprovados por comitês de ética locais e todos os participantes assinaram o termo de
consentimento livre esclarecido. | |
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