Tesis
Avaliação da ablação de CD90 em células primárias de glioblastomas humanos in vitro
Fecha
2019-04-26Registro en:
BUZOGANY, Vanessa Henriques Nogueira. Avaliação da ablação de CD90 em células primárias de glioblastomas humanos in vitro. 2018. 86 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018.
Autor
Buzogany, Vanessa Henriques Nogueira
Institución
Resumen
Os gliomas representam os tumores do sistema nervoso central (SNC) mais comuns e com alta taxa de incidência. Entre eles, o glioblastoma multiforme (GBM) é extremamente agressivo e com grande heterogeneidade intratumoral, sendo classificado como grau IV de acordo com a OMS. O paciente é submetido ao tratamento oncoquimioterápico, a Temozolomida, associado à radioterapia. Pouco se avançou em relação a evolução dos fármacos utilizados para o tratamento de GBM e os testes clínicos atuais revelam pouca melhora nas taxas de sobrevida, a qual é em média de 18 meses. Com a alta taxa de recidiva alinhada à falta de novos tratamentos, a busca por biomarcadores e a investigação biológica do GBM avançam de maneira promissora. Acredita-se que a resistência tumoral se deve à presença de células-tronco tumorais (CTC). Elas apresentam aspectos similares aos das células-tronco neuronais saudáveis, assim como a presença de certos marcadores moleculares indicadores um estado não diferenciado. A glicoproteína CD90 tem função de adesão celular no SNC e está presente em diversas células desse sistema. Porém, há estudos indicando uma superexpressão dessa proteína em CTCs de GBM, o que leva à investigação desse possível biomarcador em células primárias de GBM. A possibilidade de se utilizar de células de linhagens para o estabelecimento de metodologias e investigação de comportamentos in vitro, levou à análise da expressão de CD90 em U87MG, linhagem recorrente em estudos de GBM. Após a transdução com luciferase para futuros experimentos in vivo e ablação de CD90 para devida comparação com o controle e análise por citometria de fluxo, foi aferido que a linhagem U87MG é negativa para CD90, impossibilitando seu uso nos demais estudos. Dessa forma, amostras cirúrgicas humanas de GBM de dois pacientes foram processadas e, então, foi estabelecido o cultivo primário de GLIO1 e GLIO2. Após a ablação de CD90 nas duas amostras, obteve-se a confirmação, por citometria de fluxo, de que o grupo GLIO1 shCD90 e GLIO2 shCD90, teriam a expressão de CD90 reduzida em 42,78% e 68,6%, respectivamente. Assim, o ensaio de formação de oncoesferas foi realizado a fim de descobrir a influência de CD90 na formação de estruturas esferoides, as quais acredita-se serem compostas por CTCs. A ablação de CD90 influenciou na morfologia das oncoesferas, com menor densidade e com menor tamanho, e no número dessas estruturas entre 3 a 7 dias de cultivo, quando comparada com o grupo controle, tanto em GLIO1 quanto em GLIO2. Foi avaliada, também, a migração celular pelo teste in vitro de wound healing e CD90 demonstrou influência no tempo de fechamento da área do scratch, com o grupo GLIO2 shCD90 não tendo a mesma capacidade de migração celular quanto o grupo controle, GLIO2 WT. Ao mesmo tempo, realizou-se o teste de adesão por análise celular em tempo real (RTCA), o qual comprovou a influência da gliocoproteína na adesão e espalhamento das células em baixa (5x103), média (10x103) e alta (20x103) confluências. Portanto, esse trabalho permite inferir a influência do nível de expressão de CD90 em células primárias de GBM, sendo importante na migração, invasão e formação de nichos com CTCs, os quais irão propagar o tumor e conferir maior resistência oncoquimioterápica. Além disso, é evidenciada a importância de se realizarem mais estudos com o cultivo primário devido às diferenças biológicas encontradas nas duas amostras de tumor. A maior investigação de CD90 permitirá tanto a busca para tratamentos mais eficazes quanto para a predição do prognóstico mais assertivo quanto à característica tumoral.