Caracterização do promotor do gene da piruvato descarboxilase (pdc) de Zymomonas mobilis

Abstract

A bactéria Zymomonas mobilis é um microrganismo que se tornou comercialmente interessante, devido às suas características fermentativas e metabólicas, principalmente para as indústrias energética e química. Esse microrganismo pode ser geneticamente manipulado e com isso é possível obter maiores titulações de bioprodutos, porém não existem muitas ferramentas genéticas desenvolvidas para que esta bactéria seja manipulada com eficiência. Esse estudo teve como objetivo caracterizar o promotor do gene (pdc) da piruvato descarboxilase de Z. mobilis responsável por codificar a proteína Pdc, enzima chave na produção de etanol por esta bactéria. Foram construídos vetores utilizando como base o plasmídeo pB1PDC, contendo o promotor pdc de 500 pb controlando a expressão do gene codificador da proteína verde fluorescente, eGFP. A partir deste plasmídeo foram gerados fragmentos menores do promotor pdc. Z. mobilis ZM4 foi transformada com as construções contendo os diferentes fragmentos do Ppdc e analisada por citometria de fluxo para detectar a fluorescência de eGFP e com isso, verificar a força do promotor. Foram obtidos dois grupos diferentes quanto a intensidade da fluorescência de eGFP, o primeiro grupo com os fragmentos Ppdc146 pb e Ppdc197pb com intensidade menor de fluorescência de eGFP, enquanto o segundo grupo com os fragmentos Ppdc305, Ppdc405 e Ppdc505 com maior intensidade de fluorescência que o primeiro grupo. Estes resultados indicaram que o elemento de ligação da subunidade σ 70 sigma 70 está contido dentro do fragmento de 146 pb, pois mesmo com o menor fragmento do promotor obteve-se fluorescência. Também foi observada a presença de uma região regulatória entre as regiões -197 e -305 do promotor, que apresentou uma diferença significativa entre os índices de fluorescência. Como estratégia para identificar o elemento de ligação no promotor da subunidade sigma foram construídos oligonucleotídeos mutantes para as prováveis regiões -10 e -35 do promotor Ppdc146 pb. As sequências mutadas e não mutadas das regiões -10 e -35 foram inseridas no plasmídeo pB1PDC com Ppdc146, e foram testadas quanto a expressão da fluorescência de eGFP por citometria de fluxo. A mutação na região -10 do promotor pdc manteve atividade de eGFP, no entanto, quando a região -35 foi mutada, não houve atividade de eGFP. Portanto, a região – 35 do promotor pdc é a região mais importante, onde provavelmente ocorre a ligação da subunidade sigma 70 ao promotor, dando início ao processo de transcrição. No entanto, não foi possível definir o elemento de ligação da subunidade sigma 70 no promotor.