Tesis
Estabelecimento e Cultivo de Células em Suspensão e Uso de Biorreatores como Estratégias de Propagação de Bambus do Gênero Guadua
Fecha
2021-11-04Registro en:
QUEIROZ, Fernanda Furlan. Estabelecimento e Cultivo de Células em Suspensão e Uso de Biorreatores como Estratégias de Propagação de Bambus do Gênero Guadua. 2020. 208. f., il. Tese (Doutorado em Botânica)—Universidade de Brasília, Brasília, 2020.
Autor
Queiroz, Fernanda Furlan
Institución
Resumen
Este trabalho teve por objetivo aperfeiçoar técnicas de multiplicação clonal in vitro de Guadua magna e
Guadua aff. chaparensis, desenvolvendo estudos relacionados à calogênese, embriogênese somática e
cultura de células em suspensão, além de avaliar a aplicação de biorreatores em etapas do processo.
Investigações anatômicas e histoquímicas, além de análises moleculares, também foram realizadas para
melhor caracterizar as diferentes etapas envolvidas nos processos estudados. Para tanto, inicialmente foi
realizada a indução da calogênese em explantes formados por segmentos nodais, segmentos internodais e
bainhas foliares de plantas estabelecidas in vitro de G. magna. Os explantes foram submetidos à meio de
cultura de MS suplementado com dicamba, 2,4-D e picloram nas concentrações de 0; 6,77; 13,54; 20,31 e
27,08 μM. Aos 60 dias de cultivo, verificou-se que todos os tratamentos apresentaram formação de calos de
coloração branco-amarelada e de aspecto mucilaginoso. A análise histológica revelou zonas meristemáticas
com células em intensa divisão e formação de primórdios radiculares. As maiores percentagens de formação
de calos foram obtidas nas concentrações 20,31 μM (88,0 %), 13,54 μM (85,3 %) e 27,08 μM (74,7 %). O
maior incremento de massa fresca de calo foi verificado em 13,54 μM de picloram (402,5 mg). Os calos
formados foram inoculados em Erlenmeyer (125 mL) contendo 20 mL de meio de MS líquido, suplementado
de 4,44 μM de dicamba, 2,4-D ou picloram, onde foram avaliadas quatro diferentes origens de calos da etapa
de indução de calos para o estabelecimento: 13,54 μM de dicamba (T1), 13,54 μM de 2,4-D (T2), 13,54 μM
de picloram (T3) ou 20,31 μM de picloram (T4). Após seis subculturas de 30 dias cada, T3 e T4 apresentaram
melhores índices de estabelecimento (100 % e 83,3 %, respectivamente), incremento da massa fresca e
massa seca dos cultivos celulares em suspensão. A partir de análise citoquímica, os cultivos em T3 e T4
apresentaram aglomerados de células avermelhadas, o que as qualifica como positivas quanto à viabilidade
embriogênica, conferindo à esses tratamentos as melhores condições de cultivo para tal finalidade. Num
segundo capítulo, segmentos nodais de plantas cultivadas in vitro da espécie Guadua aff. chaparensis foram
inoculados em meio de cultura de MS com 2,4-D e picloram, nas concentrações 11,1 μM ou 22,2 μM para
indução da embriogênese somática. Após 120 dias de cultivo, foram observados quatro calos
morfologicamente distintos: (1) gelatinosos em 11,1 μM de 2,4-D, (2) compactos em 22,2 μM de 2,4-D, (3)
friáveis em 11,1 μM de picloram e (4) compactos nodulares em 22,2 μM de picloram. Nos calos friáveis foi
observado a formação de pró-embriões, uma característica decisiva para a progressão de embriões
somáticos, e também a presença de grãos de amido. Os calos friáveis foram submetidos a cultura líquida sob
agitação para a obtenção de cultivos celulares em suspensão nos tratamentos T1- controle, T2- 4,44 μM de
2,4-D, T3- 4,44 μM de picloram ou T4- combinação das auxinas. Todos os tratamentos proporcionaram células
com viabilidade embriogênica verificadas com a análise citoquímica, exceto T1- controle. Após o
estabelecimento e a multiplicação das culturas celulares, foi realizado o restabelecimento de calos, a partir
de alíquotas de 20 μL dos cultivos ressuspendidas em meio de MS nos tratamentos com 2,4-D e picloram,
nas concentrações de 0; 6,77; 13,54; 20,31 e 27,08 μM. Tais calos apresentaram aspecto friável e, a partir da
análise anatômica, foram observados pró-embriões somáticos. Por fim, num terceiro capítulo, realizou-se a
multiplicação de propágulos vegetativos de G. magna em diferentes sistemas de cultivo in vitro: T1 MLC- Meio
Líquido Convencional; T2 MLA- Meio sob Agitação, T3 BIPER- Biorreatores de Imersão Permanente e T4
BIT- Biorreator de Imersão Temporária. Após 90 dias de cultivo, BIPER e BIT apresentaram maiores médias
de sobrevivência dos propágulos em cultivo, número de brotações, altura de brotações e massa fresca, bem
como conteúdo de clorofila a, b e carotenóides. A partir da análise de extravasamento de eletrólitos, foi
possível verificar que em todos os tratamentos os danos à membrana foram relativamente baixos nos
sistemas de cultura (≤ 33,5), exceto no T2-MLA (60,4). Na análise dos componentes bioquímicos
(AST/Amido), as mudas de G. magna cultivadas em T3-BIPER e T4-BIT, consumiram em maior quantidade
suas reservas de carboidratos (AST). A análise anatômica revelou a presença de regiões meristemáticas,
células de primórdios foliares e radiculares, e meristema apical de caule, ou seja, que as mudas propagadas
continham a estrutura celular básica necessária para o desenvolvimento de novos brotos e raízes. Também
foi possível visualizar a conexão entre o sistema vascular do caule e as folhas, onde um ou mais feixes
vasculares são orientados para as folhas. Quanto à aclimatização, as melhores taxas de sobrevivência foram
obtidas das plantas de G. magna advindas dos tratamentos T3-BIPER e T4-BIT, com ocorrência de
enraizamento adventício espontâneo. Para análise da fidelidade genética, a partir de marcadores moleculares
ISSR’s, os indivíduos analisados apresentaram entre si 100 % de similaridade em todos tratamentos, e os
somaclones diferiram em média menos de 0,2 %. Conclui-se que, as informações inéditas geradas neste
trabalho podem ser úteis para contribuir no entendimento dos aspectos biológicos, fisiológicos e bioquímicos
durante o processo de cultivo in vitro de G. magna e G. aff. chaparensis e assim também para o
aperfeiçoamento da multiplicação clonal em sistemas de cultivo in vitro, inclusive para outras espécies de
bambu.