Tesis
Redução do Teor de Ácido Fítico em Sementes de Soja Mediado por CRISPR e na RNA Interferente
Fecha
2021-08-13Registro en:
SOUZA, Jéssica Carrijo de. Redução do Teor de Ácido Fítico em Sementes de Soja Mediado por CRISPR e na RNA Interferente. 2021. 98 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2021.
Autor
Souza, Jéssica Carrijo de
Institución
Resumen
A maior parte do fósforo encontrado nas sementes de soja está acumulada na forma de ácido
fítico, representando mais de 85% do fósforo total. Sua biossíntese ocorre através da via do
inositol-fosfato. Quando esta molécula está na forma de sal, fitato, é considerado um fator
antinutricional, pois limita a disponibilidade de alguns nutrientes essenciais, diminuindo o valor
nutricional das ementes. Além disso, o ácido fítico não é digerível pelos monogástricos, sendo
amplamente excretado em vez de absorvido, podendo resultar no acúmulo de fósforo nos solos,
causando também poluição das águas. De modo que o objetivo deste trabalho foi desenvolver
uma linhagem de soja com reduzido teor de ácido fítico, por meio da engenharia genética. Para
isso, foram utilizadas duas metodologias, CRISPR e RNA interferente. Inicialmente duas
configurações do sistema CRISPR foram avaliadas por hairy-root. (1) Um cassete simplificado
(STU) onde tanto a Cas9 quanto os RNA guias (sgRNA) são controlados por um mesmo
promotor, versus (2) um cassete tradicional (TCTU), mais comumente utilizado, onde a Cas9
está sob a regulação de um promotor e cada sgRNA por outro promotor (TCTU). O sistema STU
aqui utilizado, permitiu uma redução de mais de 1.000pb no tamanho dos vetores de
transformação. Foram escolhidos dois genes que atuam ao final da via de biossíntese do ácido
fítico, GmIPK1 e GmIPK2. Os resultados indicaram que o sistema tradicional se apresentou mais
eficiente em gerar edições no genoma das raízes de soja, embora os dois sistemas tenham
demonstrado funcionalidade. O cassete TCTU foi então escolhido para gerar os transformantes
definitivos de soja via sistema biobalístico de transformação. Plantas com edição em ambos os
genes (GmIPK1 e GmIPK2) foram geradas individualmente, e o conteúdo de ácido fítico foram
avaliados, destacando assim 3 eventos: IPK1-5D2 (11,56%) IPK2-24B2 (14,11%) IPK2-24C4
(25,35%) que apresentaram uma aparente redução de ácido fítico sem alteração nas
características agronômicas. Também foram geradas plantas de soja transformadas utilizando a
técnica de RNA interferente para redução da expressão do gene GmIPK2. Análises da
quantidade de ácido fítico foram avaliadas nas plantas geradas destacando 3 eventos IPK2-
RNAi_1A1 (23,96%) IPK2-RNAi_1D2 (41,67%) e IPK2-RNAi_7C2 (13,71%) com aparente
redução. Foi observado alterações no fenótipo da linhagem 1D2 com retardo no desenvolvimento
e baixa produtividade. No entanto a linhagem 1A1 se mostrou um potencial candidato, visto ter
apresentado redução de ácido fítico sem alterações fenotípicas. A utilização de ambas as
metodologias (CRISPR e RNAi), foram eficazes na geração de plantas de soja com redução no
conteúdo de ácido fítico em sementes. No entanto novos experimentos ainda são necessários
para compreender a natureza das mutações para os eventos CRISPRs além de avaliar a
biodisponibilidade de nutrientes nas sementes após a redução do ácido fítico em todos os
eventos com destaque gerados nesse trabalho.