Tesis
Enriquecimento de proteínas parceiras de KAHRP e mapeamento de proteínas organelares de Plasmodium falciparum utilizando CRISPR-Cas9, APEX2 e proteômica
Fecha
2021-11-04Registro en:
OLIVEIRA, Lucas Silva de. Enriquecimento de proteínas parceiras de KAHRP e mapeamento de proteínas organelares de Plasmodium falciparum utilizando CRISPR-Cas9, APEX2 e proteômica. 2021. 256 f., il. Tese (Doutorado em Patologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2021.
Autor
Oliveira, Lucas Silva de
Institución
Resumen
A malária é uma doença tropical, causada por espécies do gênero Plasmodium spp. O Plasmodium
falciparum é a espécie mais virulenta, pois é a única capaz de produzir o quadro clínico mais grave
da doença: a malária cerebral. De acordo com as últimas estimativas, cerca de 229 milhões de
pessoas são acometidas pela malária, e, estudos que possam viabilizar a descoberta de novos
alvos terapêuticos se tornam altamente necessários, haja vista aos crescentes casos de
resistência aos antimaláricos disponíveis. Neste sentido, a fim de poder explorar melhor os
parceiros de interação com a proteína KAHRP (do inglês, knob-associated histidine rich protein),
uma proteína relacionada à citoaderência ao endotélio do hospedeiro humano facilitando a
formação de “rosetas” em P. falciparum, foi implementado o uso de CRISPR-Cas9 juntamente com
a abordagem de marcação por proximidade mediada por ascorbato-peroxidase modificada
(APEX2), a fim de criar uma proteína quimérica da KAHRP fusionada a APEX2 por knock-in,
utilizando o sistema CRISPR-Cas9, com a finalidade de promover a biotinilação de proteínas
vizinhas parceiras. Para avaliar a funcionalidade da proteína quimérica KAHRP-Flag-APEX2 ,
ensaios de validação por Western-blot, estreptavidina-blot e imunofluorescência foram realizados.
As análises de proteômica e de bioinformática revelaram que dentre as 208 proteínas do parasita
biotiniladas vizinhas da KAHRP-Flag-APEX2, algumas delas são preditas por serem exportadas
pelo translocon PTEX presente na membrana do vacúolo parasitóforo, e, outras preditas por
serem exportadas por mecanismos não clássicos. Dentre as proteínas observadas, encontramos:
GBP130, PTP2, membros do grupo PHISTb, UIS2, Pf332, RESA, as proteínas que compõe o
complexo RhopH/CLAG (RhopH1/CLAG3.1, RhopH2 e RhopH3) e do complexo PTEX: PTEX88
e 150. Adicionalmente, seguindo o princípio da acurácia e proximidade proporcionada pelo uso da
APEX2, construções similares foram realizadas, a fim de endereçar a HA-APEX2 para algumas
organelas de P. falciparum. Pelo fato do parasita apresentar organelas especializadas, tais como
o apicoplasto e as roptrias, o conhecimento do arsenal de proteínas presentes nestas estruturas,
podem fornecer evidências para que futuras estratégias para a erradicação da doença, baseado
no desenvolvimento de quimioterápicos e/ou vacinas sejam realizadas. O uso da APEX2 tem se
mostrado altamente eficiente nesse quesito, pois permite uma descrição altamente precisa acerca
das proteínas presentes em uma organela de interesse, baseando-se na sua resolução temporal
e espacial. Assim, construções epissomais foram adicionalmente obtidas, endereçando a HA-
APEX2 para o apicoplasto (pCC1-SP(ACP)-HA-APEX2), a mitocôndria (pCC1-SP(TrxR)-HA-APEX2) e
as roptrias (pCC1-SP(RAP1)-HA-APEX2). O controle citosólico também foi obtido (pCC1-HA(cito)-
APEX2). Com a mudança da metodologia de transfecção com o uso da plataforma Amaxa II
Nucleofector II AAD-1001N (Lonza) e a determinação da ineficácia da droga anti-folato WR99210
proveniente da Sigma-Aldrich para selecionar os parasitas mutantes por [3H] hipoxantina, a obtenção
dos parasitas transfectados foi possível após 3-4 semanas de seleção. Os ensaios de validação da
expressão e da marcação por biotinilação propiciada pela APEX2 por Western-blot e
estreptavidina-blot dos respectivos compartimentos estão em andamento.