Estudo da participação de microRNAs na regulação da resposta imune inata de macrófagos murinos à infecção por Paracoccidioides brasiliensis

Abstract

Durante o processo de interação patógeno-hospedeiro ambos os organismos envolvidos sofrem uma ampla reprogramação do padrão global de expressão gênica, o que tem sido mostrado ser crucial na definição da resultante dessa interação. Dentre os inúmeros genes com expressão alterada no hospedeiro encontram- se aqueles que codificam microRNAs (miRNAs), um grupo de pequenas moléculas de RNA regulatórias atuante nos mais diversos processos celulares, incluindo a regulação da resposta imune tanto inata quanto adaptativa. Embora vários trabalhos venham mostrando a importância dos miRNAs na resposta imune de hospedeiros mamíferos a bactérias e vírus, pouco se sabe a respeito do papel desses reguladores em infecções fúngicas. Nesse sentido, buscamos analisar o papel de miRNAs na resposta imune inata de hospedeiros murinos à infecção por Paracoccidioides brasiliensis, um dos agentes etiológicos da Paracoccidioidomicose (PCM), considerada a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. Os ensaios iniciais com macrófagos peritoneais de camundongos das linhagens A/J e B10.a, modelos definidos de resistência e suscetibilidade à PCM, respectivamente, e leveduras do isolado virulento Pb18 de P. brasiliensis revelaram o aumento dos cinco miRNAs avaliados: miR-125b, miR-132, miR-146a, miR-155 e miR-455, sugerindo a participação dessas moléculas na regulação da resposta a P. brasiliensis. No entanto, a ausência de um padrão de indução distinto entre as duas linhagens possivelmente indica que os miRNAs avaliados não possuem papel determinante no estabelecimento de respostas distintas entre as duas linhagens nas fases iniciais da interação com o fungo. Devido seu papel chave na regulação da resposta imune e aos altos níveis de acúmulo diferencial em resposta a P. brasiliensis aqui descritos, o miRNA miR-155 foi escolhido para análises mais abrangentes envolvendo sua biogênese e ação na modulação de transcritos alvo. O acúmulo do precursor pri-miR-155 observado sugere uma maior transcrição do gene MIR155HG contribuindo em parte para os altos níveis do miRNA maduro. Por sua vez, o aumento na razão entre os níveis de miR-155-3p e miR-155-5p pode indicar uma modulação do grau de estabilidade da fita 3p e regulação de seus processos de decaimento. A avaliação dos níveis de transcritos alvo de miR-155-5p forneceu resultados variáveis. Enquanto o aumento de TNFα e redução de SHIP1 estão de acordo com o já descrito na literatura em resposta a miR-155, o aumento nos níveis de SOCS1 e SOCS3, negativamente regulados pelo miRNA, demonstra as dificuldades de se estabelecer paralelos diretos entre os níveis de um miRNA e seus alvos em um contexto de alta reprogramação do padrão global de expressão gênica. Também foram realizados ensaios de infecção empregando macrófagos derivados de medula de animais nocautes para os genes de TLR4 e dectina-1 para avaliação da sua participação na modulação dos níveis de miR-155-5p. Os resultados obtidos evidenciam a sinalização desses receptores de membrana como reguladores negativos, direta ou indiretamente, de miR-155-5p em resposta a P. brasiliensis. Para possibilitar o estudo do papel funcional de miRNAs na resposta imune, experimentos foram realizados visando validar um modelo de silenciamento de miRNAs através da transfecção in vitro de inibidores (antimiR). Resultados preliminares utilizando sondas marcados com fluorescência e inibidores de um miRNA controle demonstraram uma alta eficiência de transfecção de BMDMs e eficácia no silenciamento do miRNA controle let-7. Desta forma, os resultados aqui apresentados são de relevância por sugerirem, pela primeira vez, a participação de miRNAs na regulação de vias envolvidas na resposta imune inata a P. brasiliensis.