Determinación del Potencial de Citotoxicidad de Parasporinas tipo PS2Aa1 Obtenidas por Evolución Dirigida, en Células de Cáncer de Colon SW-480 y SW-620

Abstract

Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva estudiada por la producción de cristales parasporales con potencial insecticida. Recientemente, se descubrió un nuevo grupo de proteínas cristal, denominadas como parasporinas. Dentro de este nuevo grupo, se destaca la parasporina 2(PS2Aa1), que se caracteriza por exhibir efectos citotóxicos frente a diversas líneas celulares de cáncer de colon, estableciéndose como una posible alternativa a los tratamientos tradicionales para combatir esta enfermedad. Sin embargo, actualmente no se encuentra bien definido su mecanismo de acción ni los receptores involucrados. Con la actual investigación se emplearon tecnologías de mutagénesis sitio-dirigidas, con el fin de obtener variantes de PS2Aa1 mejoradas. Para ello, primero se realizó un estudio in silicio de la proteína, para buscar secuencias homologas y dominios conservados, y llevar a cabo el diseño de los primers. Luego se realizó transformación para incorporar el gen de interés con el vector pET30a a las células DE3BL21. Se llevaron a cabo los ensayos de mutagénesis sitio-dirigida asistida con PCR para obtener las mutantes a partir de PS2Aa1; a partir de la biblioteca producida, se hicieron ensayos de citotoxicidad por medio del Kit Sulforhodamine B Cell Cytoxicity Assay en células de cáncer de colon SW-480 y SW-620. A partir de estos, se pudo determinar que PS2Aa1 poseía dominios conservados de familias de proteínas β-PFT de tipo aerolisina. A partir de la mutagénesis se logró obtener una librería de numerosas mutantes, en donde solo 6 presentaron las mutaciones de interés. En los ensayos de citotoxicidad, se evidenciaron 4 mutantes que inhibieron el crecimiento de las células cancerígenas. Sin embargo, las mutantes presentaron inhibición de crecimiento en las células CHO-K1, aunque menor con respecto a la nativa, por lo cual es necesario llevar a cabo más estudios con el fin de establecer si dichos cambios fueron significativos en la estructura-función de la proteína.

Bacillus thuringiensis is a Gram-positive bacterium studied for the production of parasporal crystals with insecticide potential. Recently, a new group of crystal proteins, called parasporins, was discovered. Within this new group, parasporin 2 (PS2Aa1) stands out, which is characterized by displaying cytotoxic effects against various colon cancer cell lines, establishing itself as a possible alternative to traditional treatments to combat this disease. However, its mechanism of action and the recipients involved are currently not well defined. Current research used site-directed mutagenesis technologies to obtain improved PS2Aa1 variants. To do this, we first conducted an-in silicon study of the protein, to look for homologous sequences and conserved domains, and to carry out the design of primers. Transformation was then performed to incorporate the gene of interest with the pET30a vector into the DE3BL21 cells. PCR-assisted site-directed mutagenesis assays were conducted to obtain mutants from PS2Aa1; from the produced library, cytotoxicity assays using the Sulforhodamine B Cell Cytoxicity Assay Kit were performed on colon cancer cells SW-480 and SW-620. From these, it was possible to determine that PS2Aa1 possessed conserved domains of family of aerolysine-type β-PFT proteins. From the mutagenesis it was possible to obtain a library of numerous mutants, where only 6 presented mutations of interest. In cytotoxicity trials, 4 mutants were shown to inhibit the growth of cancer cells. However, mutants presented growth inhibition in CHO-K1 cells, although less than native, so it is necessary to carry out more studies in order to establish if such changes were significant in the structure-function of the protein.