Trabajo de grado - Doctorado
Targeted metabolomics por LC-MS/MS de la variación de carotenoides de Staphylococcus aureus asociados al estrés oxidativo y su relación con la fluidez de la membrana
Date
2022-08-22Registration in:
instname:Universidad de los Andes
reponame:Repositorio Institucional Séneca
Author
López Muñoz, Gerson Dirceu
Institutions
Abstract
La estafiloxantina (STX) es un sacarolípido derivado de un carotenoide presente en Staphylococcus aureus (S. aureus), implicado en la tolerancia al estrés oxidativo y la resistencia a péptidos antimicrobianos. Además, la STX influye en las propiedades biofísicas de la membrana bacteriana y ha sido asociada a la formación de dominios lipídicos durante la resistencia a la meticilina. Sin embargo, se desconoce como S. aureus regula la formación de STX y otros carotenoides, la tolerancia al estrés oxidativo por parte de estos metabolitos, así como sus implicaciones en la viscosidad de la membrana. Por ello, en esta investigación se desarrolló un método de cromatografía líquida acoplado a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para caracterizar simultáneamente todos los compuestos químicos asociados a la ruta biosintética de los carotenoides de S. aureus. Un total de 34 metabolitos relacionados a la biosíntesis de STX fueron identificados en una cepa silvestre, además se propuso una ruta biosintética alterna para la cepa SA147 que tenía inhibida la biosíntesis de los carotenoides, la cual se regeneró al contener el plásmido crtMN. La separación cromatográfica se obtuvo empleando columnas con rellenos C18 y C30, demostrando que la biosíntesis de los carotenoides se activa en la en la fase exponencial tardía (8h). Adicionalmente, el método LC-MS/MS permitió estudiar la conversión de carotenoides en el tiempo, evidenciando la progresión desde los precursores de carotenoides predominantes a las 8h de cultivo hasta la formación de los carotenoides finales en la fase estacionaria (24h). También se analizó la fase estacionaria tardía (48h) donde aumentó la proporción de células muertas, siendo STX uno de los componentes principales, pero no el único. Pues se elucidó un equilibrio químico entre el ácido 4,4'-diaponeouroesporenóico y STX durante la dinámica biosintética de los carotenoides, donde el sistema conformado por estas dos biomoléculas podría relacionarse como agentes reguladores de las propiedades biofísicas de la membrana bacteriana.
Otro de los objetivos de esta investigación consistió en evaluar metodologías para la extracción de los carotenoides bacterianos, mediante la modernización del método clásico de extracción empleado por más de cuatro décadas, encontrando un incremento de significativo en los rendimientos. También se estudiaron métodos no convencionales de
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extracción, siendo la extracción con líquidos presurizados (PLE) el método más selectivo a STX, al presentar los mejores rendimientos de recuperación cuando se utilizó etanol como disolvente. Estos resultados demostraron la posibilidad de reemplazar el metanol empleado en el método clásico por etanol, un disolvente que reduciría el impacto al ambiente. A su vez, se evaluó la capacidad antioxidante in vitro en cinco cepas de S. aureus mediante los ensayos DPPH y ORAC-lipofílico, demostrando que las cepas que producen carotenoides presentan la mejor capacidad antioxidante.
Por otra parte, para evaluar la asociación entre la capacidad protectora de los carotenoides a condiciones de estrés y su incidencia en las propiedades de la membrana bacteriana, se determinó la viabilidad celular entre cepas que sintetizan carotenoides de las que no lo hacen. Encontrando una diferencia de un orden de magnitud en las unidades formadoras de colonias (UFC) cuando cepas de S. aureus y S. carnosus (contiene genes productores de carotenoides de S. aureus) fueron expuestas a una fuente generadora de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (plasma atmosférico frío, CAP), usado como método bactericida en infecciones cutáneas y bucales. Asimismo, la disminución estadísticamente significativa de los carotenoides cuantificados por el método LC-MS/MS indicó la eficiencia de CAP en degradar estos metabolitos en ambas bacterias. Además, el análisis de permeabilización de la membrana demostró una menor concentración de iones potasio liberado en las cepas productoras de carotenoides después de ser expuestas a CAP. Al analizar los extractos obtenidos después del tratamiento con CAP, ambas bacterias presentaron mayor fluidez debido a la oxidación de los carotenoides. Asimismo, al evaluar la concentración de carotenoides en las cepas de S. aureus expuestas a desecación durante uno y siete días, se demostró que la resistencia a desecación está relacionada con la mayor concentración de carotenoides, medición que también fue realizada con el método LC-MS/MS desarrollado.
Adicionalmente, se determinaron las cantidades de los ácidos grasos mediante cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas (GC-MS). Estos análisis mostraron que los ácidos grasos de mayor abundancia en la membrana bacteriana tienen cadenas de 15 y 17 unidades de carbono, coincidiendo con los homólogos principales de STX,
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los cuales fueron caracterizados por LC-MS/MS. Asimismo, se identificaron ácidos grasos entre 10 a 22 unidades de carbonos, algunos de las cuales también se encuentran enlazados al núcleo de STX, identificados por LC-MS/MS.
Por último, empleando espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) en sistemas de lípidos modelo (incluido un lípido deuterado) y sistemas in vivo, se confirmó que los carotenoides contribuyen a modular las propiedades biofísicas en la membrana de S. aureus. Se determinó que los carotenoides aumentan la rigidez de la membrana bacteriana a la temperatura de crecimiento (37°C) correspondiente a la fase líquido cristalina, que coincide a lo reportado usando sondas fluorescentes. Al mismo tiempo, los resultados FTIR también demostrarían que, con el aumento de la concentración de los carotenoides en la bacteria a bajas temperaturas ocurre un cambio en las temperaturas de transición (Tm) entre la fase gel y la líquido-cristalina, tornándose más fluida la membrana, algo por primera vez reportado para S. aureus. Resultados que confirmarían lo que se ha planteado para STX, carotenoide que cumpliría funciones semejantes al colesterol en células eucariotas, mientras que a altas temperaturas aumenta el nivel de empaquetamiento generando estabilidad, a bajas temperaturas se evita la agrupación de fosfolípidos por intercalación entre las colas lipídicas.
En conclusión, mediante metodologías LC-MS/MS enfocadas al análisis de los carotenoides de S. aureus, así como el desarrollo de ensayos químicos y microbiológicos, fue posible elucidar la dinámica bioquímica que ocurre durante la biosíntesis metabólica de estos compuestos. Incluyendo la identificación de su diversidad molecular, comprendiendo con mayor detalle las propiedades de tolerancia a condiciones de estrés oxidativo asociadas a estos carotenoides. Sumado al estudio sobre el impacto que tienen en las propiedades biofísicas de la membrana bacteriana mediante análisis in vivo y con lípidos modelo empleando FTIR, sin la necesidad de sondas adicionales que se utilizan en métodos fluorescentes. Staphyloxanthin (STX) is a saccharolipid derived from a carotenoid present in Staphylococcus aureus (S. aureus), implicated in tolerance to oxidative stress and resistance to antimicrobial peptides. In addition, STX influences the biophysical properties of the bacterial membrane and has been associated with the formation of lipid domains during methicillin resistance. However, it is unknown how S. aureus regulates the formation of STX and other carotenoids, the tolerance to oxidative stress by these metabolites, as well as their implications on membrane viscosity. Therefore, in this research, a liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was developed to simultaneously characterize all chemical compounds associated with the carotenoid biosynthetic pathway of S. aureus. A total of 34 metabolites related to STX biosynthesis were identified in a wild-type strain, and an alternative biosynthetic pathway was proposed for strain SA147 that had inhibited carotenoid biosynthesis, which was regenerated by containing the crtMN plasmid. Chromatographic separation was obtained using C18- and C30-filled columns, showing that carotenoid biosynthesis is activated in the late exponential phase (8h). Additionally, the LC-MS/MS method allowed the study of carotenoid conversion over time, showing the progression from the predominant carotenoid precursors at 8h of culture to the formation of the final carotenoids in the stationary phase (24h). The late stationary phase (48h) was also analyzed where the proportion of dead cells increased, STX being one of the main components, but not the only one. A chemical equilibrium between 4,4'-diaponeourosporenoic acid and STX was elucidated during the biosynthetic dynamics of carotenoids, where the system formed by these two biomolecules could be related as regulatory agents of the biophysical properties of the bacterial membrane.
Another objective of this research was to evaluate methodologies for the extraction of bacterial carotenoids by modernizing the classical extraction method used for more than four decades, finding a significant increase in yields. Non-conventional extraction methods were also studied, being pressurized liquid extraction (PLE) the most selective method to STX, presenting the best recovery yields when ethanol was used as solvent. These results demonstrated the possibility of replacing the methanol used in the classical method with
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ethanol, a solvent that would reduce the impact on the environment. In turn, the in vitro antioxidant capacity of five strains of S. aureus was evaluated by means of DPPH and ORAC-lipophilic assays, showing that the strains that produce carotenoids present the best antioxidant capacity.
On the other hand, to evaluate the association between the protective capacity of carotenoids under stress conditions and their impact on bacterial membrane properties, cell viability was determined between strains that synthesize carotenoids and those that do not. An order of magnitude difference in colony forming units (CFU) was found when strains of S. aureus and S. carnosus (containing carotenoid-producing genes from S. aureus) were exposed to a source of reactive oxygen and nitrogen species (cold atmospheric plasma, CAP), used as a bactericidal method in cutaneous and oral infections. Also, the statistically significant decrease of carotenoids quantified by LC-MS/MS method indicated the efficiency of CAP in degrading these metabolites in both bacteria. In addition, membrane permeabilization analysis showed a lower concentration of potassium ions released in the carotenoid-producing strains after exposure to CAP. Now, when analyzing the extracts obtained after CAP treatment, both bacteria showed higher fluidity due to carotenoid oxidation. Likewise, to evaluate the concentration of carotenoids in the S. aureus strains exposed to desiccation for one and seven days, it was demonstrated that resistance to desiccation is related to the higher concentration of carotenoids, a measurement that was also performed with the LC-MS/MS method developed.
Additionally, the amounts of fatty acids were determined by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). These analyses showed that the most abundant fatty acids in the bacterial membrane have chains of 15 and 17 carbon units, coinciding with the main homologues of STX, which were characterized by LC-MS/MS. Also, fatty acids between 10 and 22 carbon units, some of which are also linked to the core of STX, were identified by LC-MS/MS.
Finally, using Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) in model lipid systems (including a deuterated lipid) and in vivo systems, it was confirmed that carotenoids contribute to modulate biophysical properties in the membrane of S. aureus. Carotenoids
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were found to increase the stiffness of the bacterial membrane at the growth temperature (37°C) corresponding to the liquid crystalline phase, which is consistent with that reported using fluorescent probes. At the same time, the FTIR results would also demonstrate that, with the increase in the concentration of carotenoids in the bacteria at low temperatures, a change in the transition temperatures (Tm) between the gel phase and the liquid-crystalline phase occurs, making the membrane more fluid, something reported for the first time for S. aureus. Results that would confirm what has been proposed for STX, a carotenoid that would fulfill similar functions to cholesterol in eukaryotic cells, while at high temperatures the level of packing increases, generating stability, at low temperatures the grouping of phospholipids is avoided by intercalation between the lipid tails.
In conclusion, by means of LC-MS/MS methodologies focused on the analysis of S. aureus carotenoids, as well as the development of chemical and microbiological assays, it was possible to elucidate the biochemical dynamics that occur during the metabolic biosynthesis of these compounds. Including the identification of their molecular diversity, understanding in greater detail the properties of tolerance to oxidative stress conditions associated with these carotenoids. In addition to the study of their impact on the biophysical properties of the bacterial membrane by in vivo and model lipid analysis using FTIR, without the need for additional probes used in fluorescent methods.