Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade em Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013.A hiperplasia adrenal congênita (HAC) é o grupo hereditário de desordens na esteroidogênese adrenal causada por uma deficiência enzimática. O gene CYP21A2 codifica a enzima 21-hidroxilase (21-OH) e mutações nesse gene podem provocar HAC. Localizado no em 6p21.3 ele integra o módulo RCCX formado pelos genes RP, C4, CYP21 e TNX, que estão organizados em repetições em tandem, submetendo-o a eventos de recombinações gênicas não-alélicas o que resulta em região altamente polimórfica. CYP21A2 e seu homólogo, o pseudogene CYP21A1P, são similares em 96% na região intrônica e de 98% na região exônica, o que promove a troca de fragmentos de DNA entre eles. HAC pela deficiência da 21-OH é autossômica recessiva e é classificada nas formas perdedora de sal (PS) e virilizante simples (VS), ambas com virilização pré-natal da genitália externa feminina. A deficiência de aldosterona caracteriza a forma perdedora de sal, que constitui 75% dos casos da forma clássica. A deficiência da 3β-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 2 (3βHSD2) representa uma rara variante da HAC. Também é autossômica recessiva, codificada pelo gene HSD3B2, localizado em 1p13.1. Esta enzima afeta todas as três vias esteroidogênicas e o espectro fenotípico é amplo e varia desde perdedor de sal grave até a forma não-perdedora, com ou sem formação de genitália ambígua em neonatos 46,XY. Este trabalho tem por objetivo investigar e descrever a variabilidade genética numa série de indivíduos com o diagnóstico clínico da forma clássica de HAC pela deficiência da 21-OH ou pela deficiência da 3β-HSD residentes no Distrito Federal (DF) e padronizar um método eficiente de diagnóstico molecular para HAC no DF. Foram selecionados 29 pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial de deficiência de 21-hidroxilase e 1 paciente com deficiência de 3β-HSD, atendidos no Ambulatório de Endocrinologia de Gônadas e Adrenais e na Unidade de Endocrinologia Pediátrica do Hospital Universitário de Brasília. O DNA genômico foi extraído pelo método de Salting-out e a análise molecular foi realizada inicialmente pelo método de sequenciamento automático; nos indivíduos com deficiência de 21-OH, associou-se o Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification – MLPA. Foram descritas as mutações presentes nos 30 portadores de HAC. No CYP21A2, foram descritas 13 mutações de ponto e uma nova mutação missense, p.L12M. Adicionalmente, foram identificados oito alelos apresentando grandes deleções, quatro alelos com inserções e quatro com grandes conversões. A mutação mais frequente foi I2 Splice (IVS2-13A/C>G) ocorrendo em 34,5% dos indivíduos. Além disso, 72,4% dos indivíduos são heterozigotos compostos e a correlação genótipo-fenótipo foi observada em 64,2% dos indivíduos. No gene HSD3B2 foi encontrada uma homozigose para p.P222Q. O caso descrito aqui corrobora a forte correlação entre o genótipo e o fenótipo associado à mutação p.P222Q. A investigação molecular do gene CY21A2 é interessante por ser altamente polimórfico. O estudo molecular do HSD3B2 é importante pela raridade e necessidade de maior conhecimento sobre suas características genéticas. Por fim, descrevemos os defeitos genéticos responsáveis pela HAC nessa série de indivíduos e padronizamos o sequenciamento associado ao MLPA como um método eficaz para o diagnóstico molecular da HAC por deficiência da 21-hidroxilase. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTCongenital adrenal hyperplasia (CAH) is a group of inherited disorders of steroidogenesis caused by an enzyme deficiency. The CYP21A2 gene encodes the enzyme 21-hydroxylase (21-OH) and mutations in this gene can cause CAH. Located in the 6p21.3, it integrates the RCCX module, formed by the genes RP, C4, CYP21 and TNX, which are arranged in tandem repeats. This leads to a highly polymorphic region, in which events of non-allelic genetic recombination frequently occur. CYP21A2 and its counterpart, the pseudogene CYP21A1P, are similar at 96% in the intronic region and 98% in the exonic, which promotes the exchange of DNA fragments between them. Classic HAC caused by 21-OH deficiency is autosomal recessive and is classified as salt wasting (PS) and simple virilizing (SV) forms, both with prenatal virilization of female external genitalia. Aldosterone deficiency characterizes the salt-wasting form, which constitutes 75% of cases of classical form. 3β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (3βHSD2) deficiency is a rare variant of CAH. It is also autosomal recessive, encoded by the HSD3B2 gene, located at 1p13.1. This disorder affects all three steroidogenic pathways, and the phenotypic spectrum is broad, ranging from severe salt-losing to a non-loser, with or without formation of ambiguous genitalia in newborns 46, XY. Our aims were to investigate and describe the genetic variability in a series of individuals from the Federal District, Brazil, with a clinical diagnosis of the classic form of CAH due to 21-OH deficiency or to 3β-HSD deficiency, and to standardize an efficient method of molecular diagnosis of CAH. We selected 29 patients with clinical and laboratory diagnosis of 21-hydroxylase deficiency and one patient with deficiency of 3β-HSD from the Gonadal and Adrenal Diseases Clinics and Pediatric Endocrinology Unit, at the University Hospital of Brasilia. Genomic DNA was extracted by the salting-out method and molecular analysis was initially performed by automatic sequencing; in the subjects with 21-OH deficiency, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA was also performed. A significant variable profile of mutations were present in the 30 patients with CAH. In CYP21A2, 13 point mutations and a new missense mutation, p.L12M, were described. Additionally, we identified eight alleles presenting large deletions, four alleles with large insertions and four conversions. The most frequent mutation was I2 splice (IVS2-13A / C> G) occurring in 34.5% of the subjects. Furthermore, 72.4% of the individuals were compound heterozygotes. Genotype-phenotype correlations were observed in 64.2% of the cases. In the HSD3B2 gene, the homozygous p.P222Q mutation was found. The case described herein confirms the strong correlation between genotype and phenotype associated with this mutation. Molecular investigation of the highly polymorphic CY21A2 gene is interesting and useful. Molecular analysis of the HSD3B2 gene is important for the rarity of the disorder and the need for greater knowledge of their genetic characteristics. Finally, we described the genetic defects associated with the classic forms of CAH in these subjects, and standardized genetic sequencing associated with MLPA as an efficient method for the molecular diagnosis of CAH due to 21-hydroxylase deficiency.