Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2011.A soja é uma cultura de grande importância econômica no Brasil. No entanto, vários fatores bióticos afetam sua produtividade. Entre esse fatores destacam-se os danos causados por insetos-praga, como lagartas desfolhadoras e por fitonematoides. Várias estratégias envolvendo transgenia têm sido desenvolvidas para o controle de pragas e doenças, sendo importante o uso de promotores gênicos capazes de direcionar a expressão de transgenes nos tecidos atacados, atingindo níveis adequados para desencadear a proteção vegetal. Vários trabalhos sugerem um importante papel da via ubiquitina-proteassoma ao longo do desenvolvimento das plantas, assim como em resposta a estresses bióticos. Particularmente, genes codificadores de enzima de conjugação a ubiquitina (E2) mostraram ser ativados em sítio de alimentação de Meloidogyne incognita e em resposta ao ataque de insetos. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo determinar o perfil de expressão transcricional do gene E2 em diferentes tecidos de soja, em diferentes fases do desenvolvimento, em raízes inoculadas com M. incognita e folhas infestadas por Anticarsia gemmatalis, pela técnica de qRT-PCR, como caracterização de promotor cognato UceS8.3, previamente isolado e patenteado. Para a normalização do gene E2 nos experimentos de qPCR, oito genes de referência clássicos foram selecionados e validados quanto a sua estabilidade de expressão nas diferentes condições experimentais analisadas. Os melhores genes de referência foram utilizados na quantificação dos níveis do transcrito do gene E2. O acúmulo de transcritos de E2 foi determinado espacial e temporalmente, nos orgãos de raiz, caule, folha, flor e vagem, nos fases de desenvolvimento (V4, R2 e R4). Foi observado que ocorre acúmulo de transcritos de E2 em R4, provavelmente relacionado a senescência da planta. Em seguida, bioensaios foram conduzidos em raízes de soja inoculadas com juvenis de segundo estádio (J2) de M. incognita, e em folhas infestadas com lagartas de quarto ínstar de A. gemmatalis. Nas interações com nematóide e com insetos, foi detectado acúmulo de transcritos de E2 de 2 a 6 vezes. Paralelamente, o banco de bibliotecas subtrativas GENOSOJA foi utilizado para verificar acúmulo de transcritos de E2 em resposta a estresses (bióticos e abióticos). As análises in silico mostraram que o gene E2 é mais abundante em resposta a bactéria Bradirhyzobium japonicum, ao fungo Phakopsora pachyrhyzi e ao estresse hídrico. Os resultados obtidos de quantificação de transcritos de E2 e da análise in silico foram relacionados a cis-elementos presentes na região regulatória, e indicam que o promotor UceS8.3 representa uma importante ferramenta biotecnológica para obtenção de plantas geneticamente modificadas resistentes a fitonematóides, doenças fúngicas, insetos desfolhadores e/ou deficiência hídrica. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTSoybean is a crop of great economic importance in Brazil. However, several biotic factors have been affecting soya productivity. Among them, the damage caused by insect pests such as defoliating caterpillars and plant nematodes. Several strategies involving transgenic plants have been developed to control pests and diseases, being important the utilization of gene promoters capable of driving transgene expression in tissues attacked, at appropriate levels to trigger plant protection. Several studies suggest an important role of ubiquitin-proteasome pathway during plant development and in plant responses to biotic stresses. Particularly, genes encoding ubiquitin conjugation factors (E2) have been shown to be activated in feeding sites of Meloidogyne incognita and in response to insect attack. In this context, this study aims to determine the accumulation of the E2 transcripts considering different tissues of soybean, different stages of development, roots inoculated with M. incognita and leaves infested with Anticarsia gemmatalis, by qRT-PCR technique in order to further characterize its cognate promoter (UceS8.3). Aiming E2 gene normalization in qPCR experiments, eight classical reference genes were selected and validated for their expression stability. The best reference genes were used in the normalization of the E2 gene. To characterize the spatial and temporal accumulation of E2 transcripts, samples of root, stem, leaf, flower and pod were collected at three different developmental stages (V4, R2 and R4). It was found that E2 transcripts accumulated in R4, probably related to senescence process. Thus, bioassays were conducted in soybean roots inoculated with second stage juveniles (J2) of M. incognita, and leaves infested with fourth instar larvae of A. gemmatalis. Considering the nematode and caterpillars interactions, it was detected an E2 transcripts accumulation of 2 to 6 times. Parallely, the subtractive libraries bank GENOSOJA was used to verify the accumulation of E2 transcripts in response to other stresses (biotic and abiotic). In silico analysis showed that the E2 gene is more abundant in response to Bradirhyzobium japonicum bacteria, Phakopsora pachyrhyzi fungal, and to drought stress. The results were related to cis-elements present in the regulatory region, and suggested that the UceS8.3 promoter represents an important biotechnological tool to genetic modified plant generation resistant to plant nematodes, fungal diseases, defoliating insects and/or hydric deficit.