Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008.Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, agente etiológico da paracoccidioidomicose. Em humanos, a infecção inicia-se pela inalação de propágulos fúngicos que alcançam os pulmões. A parede dos microrganismos constitui um importante reservatório de macromoléculas imunoreativas e um potencial alvo para a procura de candidatos a vacinas. Em muitos patógenos, as proteínas com âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI) mostraram-se imunogênicas e importantes fatores de virulência. Assim, com o objetivo de estudar as proteínas de superfície foram efetuadas análises no banco de dados do transcriptoma de P. brasiliensis, onde pesquisou-se por proteínas GPI-ancoradas localizadas na membrana plasmática ou parede celular, bem como por proteínas que estivessem envolvidas na síntese, ligação e clivagem da âncora de GPI. Estas proteínas foram identificadas em várias categorias funcionais, tais como: (i) enzimas: glicanosiltransferases (1-3), (ii) prováveis antígenos de superfície, (iii) proteínas com papel estrutural e envolvidas na biossíntese da parede celular. Foram identificados transcritos codificantes para proteínas da via de biossíntese e hidrolise da âncora de GPI. Visando o conhecimento de mecanismos moleculares que participem da montagem e morfogênese da parede celular de P. brasiliensis, foi realizado o estudo de ?-1,3-glicanosiltransferas e 3 (PbGel3). PbGel3 mostrou-se em cópia única no genoma deste fungo com maiores níveis do transcrito e de proteína na fase miceliana. A proteína foi imunolocalizada na superfície de células leveduriformes e de micélio de P. brasiliensis. O potencial papel de PbGel3p na biossíntese e remodelamento foi evidenciado pela habilidade em recuperar o fenótipo do mutante gas1? de Saccharomyces cerevisiae. O homólogo da proteína DFG5 (deficiente para o crescimento filamentoso 5) de P. brasiliensis, uma proteína glicosilada provavelmente ligada à parede celular pela rede de ?-glicana foi estudado. Estudos de interação demonstraram que a proteína PbDfg5p recombinante se liga aos componentes da matriz extracelular, sugerindo um papel importante nos passos iniciais de colonização e aderência de P. brasiliensis aos tecidos do hospedeiro. Em função de seu papel biológico, bioquímica única, organização estrutural e a ausência da maioria de seus constituintes em células de mamíferos, a parede celular é um alvo atraente para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos e essencial para o entendimento da patogênese fúngica. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACTParacoccidioides brasiliensis is a temperature dependent dimorphic fungus, the etiological agent of paracoccidioidomycosis. In human, infection starts by inhalation of fungal propagules reaching the pulmonary epithelium, where the morphogenetic conversion is correlated with changes in the cell wall composition, organization and structure. The cell wall constitute an important reservoir of immunoreactive molecules and potential target for the search of vaccine candidates. In many pathogens, the proteins with glicosilfosfatidilinositol (GPI)-anchors are immunogenic and important virulence factors. Thus, P. brasiliensis transcriptome data were analyzed for potential GPI-anchored proteins localized in plasma membrane or cell wall, as well as for proteins involved in synthesis, attachment and cleavage of the GPI anchor. The proteins were identified in several functional categories: (i) enzymes: glucanosyltransferases(1- 3), (ii) probable surface antigens, (iii) proteins involved in cell wall biosynthesis and structural role. It was identificated transcript encoding to proteins involved in GPI anchor biosynthesis and hydrolysis. In an effort to elucidate the molecular mechanisms involved in the fungus cell wall-assembling and morphogenesis it was performed the study of the B-1,3-glucanosyltransferase 3 (PbGel3). PbGel3 showed one copy in genome of this fungus with the highest level of transcript and protein in the mycelium phase. The protein was immunolocalized at the surface in both mycelium and yeast phase. The potential role of PbGel3p in cell wall biosynthesis and remodeling was evidenced by its ability to rescue the phenotype of the Saccharomyces cerevisiae gas1 mutant. The DFG5 (defective in filamentous growth) homologue of P. brasiliensis, a probably glicosylated and B-glucan linked cell-wall protein was also studied. Studies demonstrated that the recombinant PbDfg5p binds to extracellular matrix components, indicating that it can be important for initial steps leading of P. brasiliensis attachment and colonization of host tissues. Because of its essential biological role, unique biochemistry, structural organization and the absence of the most of their constituents in mammalians cells, the cell wall is an attractive target for the development of new antifungal agents and essential for understanding the fungal pathogenesis.