Trabajo de grado - Pregrado
Identificación de la proteína SUMO en trofozoítos de Entamoeba Histolytica y su participación en la eritrofagocitosis
Registro en:
T. 17. 18 S688i
Autor
Sotto Ortega, Izaid José
Institución
Resumen
130 p. Cd. RESUMEN
Titulo: Identificación de la proteína SUMO en trofozoítos de Entamoeba histolytica y su participación en la eritrofagocitosis
Autor: Izaid José Sotto Ortega
Palabras clave: Entamoeba histolytica; SUMO; vía de SUMOilación; modificaciones postraduccionales, eritrofagocitosis, producción de anticuerpos.
Descripción:
Las modificaciones postraduccionales (MPT) poseen un papel importante implicado en una variedad de procesos celulares, especialmente en la regulación de proteínas. La SUMOilación pertenece a este tipo de MPT. Este mecanismo es altamente conservado en eucariontes, además es un proceso rápido y reversible. A pesar de su importancia, la SUMOilación no está totalmente detallada en el protozoario E. histolytica. El objetivo de este estudio fue Identificar la proteína SUMO en trofozoítos de E. histolytica, así como su participación en la eritrofagocitosis.
El análisis in silico demostró la presencia de un solo gen que codifica a la proteína SUMO de la amiba, la cual, posee dos dominios necesarios para la SUMOilación y en su secuencia aminoacídica un motivo consenso ψKXE que le permitiría formar cadenas estables de SUMO, interesantemente, estas cadenas pueden interaccionar con una clase de ubiquitina ligasa E3 dirigida a SUMO (STUbl) para ser reconocida por ubiquitina, y así llevar la proteína diana poliSUMOilada a degradación proteosomal. Además, se compararon las estructuras terciarias de SUMO de E. histolytica con las de sus ortólogos en H. sapiens la isoforma 1 y 2, G. lamblia y S. cerevisiae. Por otro lado, se generaron anticuerpos específicos contra la proteína EhSUMO; se encontró por medio de ensayos de Western blot (WB) de extractos totales de proteínas de amibas la presencia de una serie de proteínas SUMOiladas en un rango entre 25 a >100 kDa, y SUMO de forma libre 17 kDa.
Los resultados de WB, evidencian cambios en proteínas SUMOiladas durante la eritrofagocitosis en amiba, demostrando su participación en la fagocitosis. Los resultados implican que la conjugación de SUMO tiene una función esencial en varios procesos biológicos en E. histolytica. Sin embargo, es necesario realizar más experimentos. TABLA DE CONTENIDO
Pag
INTRODUCCIÓN 1
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 2
1.1 DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA 2
1.2 JUSTIFICACIÓN 2
2. OBJETIVOS 3
2.1 GENERAL 3
2.2 ESPECÍFICOS 3
3. REFERENTE TEÓRICO 4
3.1 ANTECEDENTES 4
3.2 BASES TEÓRICAS 5
3.2.1 Taxonomía de E. histolytica 6
3.2.2 Morfología 6
3.2.2.1 Trofozoíto: 7
3.2.2.2 Quiste: 9
3.2.3 Ciclo de vida de E. histolytica 11
3.2.4 Mecanismo de patogenicidad de E. histolytica 14
3.2.4.1 Adherencia: 15
3.2.4.2 Citólisis: 16
3.2.4.3 Fagocitosis: 17
3.2.5 Modificaciones postraduccionales 19
3.2.5.1 Familia de proteínas de tipo ubiquitina 20
3.2.5.2 SUMO (Small Ubiquitin-llike Modifiers) 21
4. SISTEMA DE HIPÓTESIS 32
4.1 HIPÓTESIS INVESTIGATIVA 32
5. MATERIALES Y MÉTODOS 33
5.1 CLASIFICACIÓN DE LA INVSTIGACIÓN 33
5.2 POBLACIÓN DE ESTUDIO Y MUESTRA 33
5.3 DISEÑO METODOLÓGICO 33
5.3.1 Análisis in silico 33
5.3.2 Cultivo de trofozoítos de Entamoeba histolytica 34
5.3.3 Obtención y purificación de ADN genómico de Entamoeba histolytica 35
5.3.4 Extracción de RNA total 36
5.3.5 Electroforesis en geles de agarosa 37
5.3.6 Obtención de ADN complementario (ADNc) en Entamoeba histolytica 37
5.3.7 Amplificación del gen EhSUMO por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 38
5.3.8 Amplificación del gen EhSUMO por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con enzima de alta fidelidad para clonación 39
5.3.9 Purificación de ADN a partir de geles de agarosa 40
5.3.10 Ligación del producto de PCR purificado en los vectores pJET1.2/blunt, Pcold y Pneo 41
5.3.11 Preparación de bacterias competentes de Escherichia coli de las cepas DH5α y BL21 42
5.3.12 Transformación de células competentes por choque térmico 43
5.3.13 Selección de clonas transformantes por PCR 43
5.3.14 Purificación de plásmidos 44
5.3.15 Secuenciación nucleotídica 45
5.3.16 Conservación de bacterias transformadas 46
5.3.17 Expresión de proteínas recombinantes EhSumo en cepas E. coli Bl21 en vector Pcold inducidas con IPTG 46
5.3.18 Ensayo de eritrofagocitosis 47
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 48
6.1 ANÁLISIS IN SILICO DE LA PROTEÍNA SUMO EN ENTAMOEBA HISTOLYTICA 48
6.1.1 E. histolytica solo posee un gen que codifica para la proteína SUMO 48
6.1.2 Filogenia 49
6.1.3 Alineamiento in silico de las secuencias de EhSUMO con la familia SUMO de humano 51
6.1.4 Papel de EhSUMO en la vía de degradación proteosomal 53
6.1.5 Alineamiento in silico de EhSUMO con SUMO de otros organismos 59
6.1.6 Modelaje de la estructura terciaria de la proteína EhSUMO 61
6.1.7 Posibles dominios funcionales encontrado EhSUMO y en otros eucariontes 63
6.1.8 Red de interacción proteína-proteína in silico de EhSUMO 65
6.2 Obtención de anticuerpos policlonales frente a la proteína EhSUMO 67
6.2.1 Diseño de oligonucleótidos 67
6.2.2 Amplificación del gen EhSUMO a través de PCR partiendo ADNg y ADNc 67
6.2.3 Amplificación del gen EhSUMO con la enzima de alta fidelidad para clonación 69
6.2.4 Ligación del gen EhSUMO al vector de transito 71
6.2.5 Ligación de EhSUMO a los vectores pCold y pNeo 73
6.2.6 Secuenciación nucleotídica dirigida al gen EhSUMO ligado a los vectores pCold y pNeo. 76
6.2.7 Inducción y solubilidad de la proteína His-EhSUMO 79
6.2.8 Purificación de la proteína recombinante His-EhSUMO 81
6.2.9 Esquema de inmunización para la obtención de anticuerpos policlonales α-EhSUMO en ratas Distar. 83
6.2.10 Titulación de anticuerpos α-EhSUMO 85
6.2.11 Niveles de EhSUMO a diferentes tiempos de eritrofagocitosis 87
7. CONCLUSIONES 89
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 90
9. ANEXOS 107 Ej.1 ABSTRACT
Title: Identification of SUMO protein in trophozoites of Entamoeba histolytica and its participation in erythrophagocytosis
Authors: Izaid José Sotto Ortega
Key words: Entamoeba histolytica; SUMO; SUMOylation pathway; post-translational modification, erythrophagocytosis, antibody production.
Description:
Posttranslational modifications (PTM) have an important role involved in a variety of cellular processes, especially in the regulation of proteins. SUMOilación belongs to this type of PTM. This mechanism is highly conserved in eukaryotes, it is also a fast and reversible process. Despite its importance, SUMOylation is not fully detailed in the protozoan E. histolytica. The objective of this study was to identify the SUMO protein in trophozoites of E. histolytica, as well as its participation in erythrophagocytosis.
In silico analysis demonstrated the presence of a single gene that encodes the SUMO protein of the amiba, which has two domains necessary for SUMOylation and in its amino acid sequence a consensus motif ψKXE that would allow it to form stable chains of SUMO, interestingly, these chains can interact with a class of ubiquitin ligase E3 directed to SUMO (STUbl) to be recognized by ubiquitin and thus bring the target protein polySUMOylated to proteosomal degradation. In addition, the tertiary structures of SUMO of E. histolytica were compared with those of their orthologs in H. sapiens isoform 1 and 2, G. lamblia and S. cerevisiae. On the other hand, specific antibodies were generated against the EhSUMO protein; The presence of a series of SUMOylated proteins in a range between 25 to> 100 kDa, and SUMO of free form 17 kDa was found by means of Western blot (WB) assays of total protein extracts of amoebas.
The results of WB, evidence changes in SUMOylated proteins during erythrophagocytosis in amoeba, demonstrating its participation in phagocytosis. The results imply that the SUMO conjugation has an essential function in several biological processes in E. histolytica. However, it is necessary to perform more experiments.