Análise proteômica de isolados de Leishmania (Leishmania) chagasi sensíveis e resistentes à miltefosina

Abstract

Leishmaniose visceral (LV) é uma doença sistêmica, fatal se não tratada, causada por parasitas protozoários do gênero Leishmania complexo donovani, o qual abriga a espécie L. (L.) chagasi. O tratamento da LV conta com poucas opções terapêuticas, incluindo os antimoniais pentavalentes, anfotericina B e a miltefosina. A miltefosina foi recentemente aprovada na Índia como a primeira droga de administração oral para o tratamento da LV. Os mecanismos de resistência à miltefosina estão sendo elucidados em linhagens experimentais de Leishmania spp. resistentes a esta droga. Entretanto, os mecanismos de resistência à miltefosina em isolados clínicos de Leishmania são pouco conhecidos. Neste estudo foi utilizada a técnica de eletroforese bidimensional acoplada à espectrometria de massas com o objetivo de destacar e identificar proteínas que são diferencialmente expressas entre formas promastigotas de isolados clínicos de L. (L.) chagasi sensíveis (S: S1 e S2) e resistentes (R: R1 e R2) à miltefosina, obtidos de pacientes com LV que participaram de um estudo clínico realizado no Brasil para avaliar a eficácia dessa droga. Os perfis protéicos obtidos dos isolados clínicos apresentaram em média 459 spots , correspondendo a 5,7% dos produtos gênicos preditos para Leishmania spp. A análise comparativa entre os perfis protéicos dos isolados clínicos S e R permitiu a detecção de 80 spots diferencialmente expressos. Desses, 18 spots foram encontrados exclusivamente no perfil do grupo S e apenas 1 no grupo R, enquanto 48 spots apresentaram diferença quantitativa na expressão protéica entre os grupos. Os demais spots foram encontrados em um único isolado (7 em S1, 3 em S2 e 2 em R1) ou em três isolados simultaneamente (1 em S1, S2 e R1). A análise desses spots por espectrometria de massas em sistema MALDI/TOF-TOF identificou 49 spots (61,3%), os quais correspondem a 32 proteínas distintas e 7 proteínas hipotéticas. Entre as proteínas identificadas, a peroxirredoxina (expressão aumentada em R) e uma cisteíno peptidase semelhante à calpaína (exclusiva do grupo S) foram destacadas por indicar que os isolados resistentes são menos susceptíveis ao processo de morte celular programada. Estes dados sugerem que estas proteínas podem estar relacionadas com o fenótipo resistência à miltefosina

Visceral leishmaniasis is a systemic disease that is fatal if untreated and is caused by the Leishmania donovani complex, which include the Leishmania (L.) chagasi. Visceral leishmaniasis treatment relies on a few chemotherapeutic drugs including Sb(V), amphotericin B and miltefosine. Miltefosine was recently approved as the first oral drug active against visceral leishmaniasis in India. Miltefosine resistance mechanisms are being elucidated in laboratory Leishmania spp. isolates but are less clear in clinical isolates. In this study, we used comparative two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry methodologies to highlight and identify proteins that are differentially expressed between miltefosine-sensitive (S: S1 and S2) and resistant (R: R1 and R2) L. (L.) chagasi isolates from kala-azar patients included in clinical trial in Brazil, in order to assess the effectiveness of this drug. We describe here a high-resolution proteome for L. (L.) chagasi promastigotes comprising an average of 459 spots, which corresponds to 5,7% of gene products predicted for Leishmania spp. Following comparison of the whole proteome profiles between sensitive and resistant L. (L.) chagasi clinical field strains, 80 differentially expressed spots were detected. Eighteen spots were found to be specific of a sensitive group and only one of a resistant group, while 48 spots changed in intensity between these groups. The others spots were present in a unique isolates (7 in S1, 3 in S2 and 2 in R1) or in three isolates simultaneously (1 in S1, S2 e R1). MALDI/TOF-TOF mass spectrometry allowed the identification of 49 spots (61,3%) corresponding to 32 distinct protein and 7 hypothetical proteins. Among the proteins identified, the comparative proteomics screen highlighted two proteins, peroxidoxin (overexpressed in R group) and calpain-like cisteína peptidase (exclusively detected in S), differentially expressed, suggesting that programmed cell death is reduced in resistant parasite. These data suggest that these proteins may be related to resistance phenotype to miltefosine