Tesis
Uso da Citometria de Fluxo para Avaliar Os Efeitos da Alta Pressão Hidrostática em Saccharomyces Cerevisiae
Fecha
2014-02-24Registro en:
NATI, T., Uso da Citometria de Fluxo para Avaliar Os Efeitos da Alta Pressão Hidrostática em Saccharomyces Cerevisiae
Autor
FERNANDES, P. M. B.
FERNANDES, A. A. R.
LOMELI, M. M.
GUIMARAES, M. C. C.
Institución
Resumen
O objetivo principal desse trabalho foi analisar os efeitos da alta pressão hidrostática (HHP) à membrana citoplasmática de leveduras, através da utilização da técnica decitometria de fluxo. Células de Saccharomyces cerevisiae Y440 Mat a, leu2 tiveram seu crescimento e viabilidade celular avaliados por citometria de fluxo. Após submetidas a pressões de 50, 100, 150 e 200 MPa analisou-se as características morfológicas das células. Os danos causados à membrana citoplasmática foram observados através do uso dos corantes Brometo de Etídio, Bis-Oxonol e Iodeto de Propídio. Os resultados encontrados mostram que a Citometria de Fluxo baseada em dados óticos de espalhamento de luz pode ser utilizada como uma técnica relativa de contagem de células, mas não como uma técnica absoluta, devido à presença dos brotamentos. Os corantes SYTO 9 e Alexafluor conjugado à Concanavalina não foram adequados para a discriminar as duas subpopulações formadas por células com e células sem brotamento. Os fluoróforos SYTO 9 e Iodeto de Propídio se mostraram apropriados para a análise de viabilidade celular, mostrando forte correlação com a técnica de plaqueamento. As pressões de 150 e 200 MPa causaram redução no tamanho celular das leveduras S. cerevisiae. Esses resultados são explicados pelos efeitos conhecidos da HHP às células, como a repressão da síntese de biomassa, maior empacotamento dos lipídios da membrana citoplasmática e interrupção do ciclo celular. Foi observado também redução na complexidade celular de S. cerevisiae. Estes resultados são atribuídos à degradação dos componentes internos das leveduras, gerada pela aplicação de pressões hidrostáticas letais. Quanto à fisiologia celular notou-se, a partir de 150 MPa, um aumento significativo dos danos causados pela HHP. A técnica BEBOXPI, não foi capaz de detectar células no estágio inicial de estresse, na qual as bombas citoplasmáticas se tornam inativas. A análise de fisiologia celular realizada apenas com os fluoróforos BOX e PI quando comparada aos resultados obtidos com o kit live/dead mostrou excelentes resultados. Ambas as técnicas forneceram dados iguais de porcentagem de células mortas, tanto nas amostras controle quanto nas amostras tratadas. Quanto às células vivas, enquanto o Live/dead detectou apenas a viabilidade das células, o BOXPI dividiu os dados referentes às células vivas em duas subpopulações: vivas/saudáveis e vivas/estressadas. Assim, foi possível através da citometria de fluxo obter dados mais aprofundados sobre os danos causados pela HHP, principalmente os referentes a despolarização da membrana citoplasmática.