Identificação de diferentes modos de ligação do domínio N-terminal da angiotensina II com receptores AT, selvagem e mutantes

Abstract

Purpose: Our aim was to assess: a) the relative expression of endogenous and exogenous AT1 receptor in a rabbit smooth muscle cell line either expressing only the endogenous AT1 receptor or in addition the exogenous rat AT1 receptor; b) the binding affinity of the wild AT1 receptor and of the receptor bearing the Cys18Ser mutation (C18S); c) the intracellular predominance of the mutated receptor by using specific antagonists to revert the constitutive internalization and d) a possible defect in the maturation of the receptor by mutation. Methods: The real time PCR was carried out to determine the expression level of both, endogenous and exogenous AT1 receptor. The competitive binding test was used to evaluate the binding affinity of the mutant and of the wild AT1 receptor using AngII, [Lys2]-AngII or [Sar1]-AngII as ligands and 3H-AngII and 125I-AngII as radioactive tracers to find out the reason of the predominant intracellular localization of the mutant receptor. The hypothesis for constitutive internalization was tested, pre-treating the cells with the specific AT1 receptor antagonists, DuP753 or [Sar1Leu8]-AngII and the IP3 production and the intracellular calcium concentration [Ca2+]i were determined. The hypothesis that a defective maturation was also tested, using calnexin, a endoplasmic reticulum marker. Cells expressing the wild or mutant AT1 receptor conjugated with green fluorescent protein (GFP) were targeted to the anti-calnexin primary antibody and the Texas Red labeled anti-rabbit secondary antibody and then merged images were analysed under confocal microscopy. Results and conclusions: It was found that the expression of the exogenous rat AT1 receptor without the 3’,5’-UTR was much higher (about 200.000 fold) than that of the endogenous receptor expression in the rabbit arterial smooth muscle cell line, which could be responsible for the tachyphylatic effect to [Lys2]-AngII. The high expression of the recombinant receptor was probably due to the ubiquitin used as expression vector of the exogenous receptor, which is known to be a strong vector. In another approach, it was verified from the competitive binding profiles using 3H-AngII, that the affinity of C18S AT1 receptor mutant was higher to [Sar1]-AngII than to AngII whereas the binding to [Lys2]-AngII was prevented. On the other hand, when the 125IAngII was used as radiolabel, the binding to the mutant but not to the wild receptor was completed blocked. These results from binding assays showed that the lack of the second S-S bridge induced the receptor to a more unfavorable condition to bind AngII rather than [Sar1]-AngII whereas the mutation completely blocked the receptor to bind [Lys2]-AngII. Furthermore the mutation led the AT1 receptor to acquire a conformation causing a different binding mode that drastically affected the binding of 125I-AngII, probably due to the monoiodinated Tyr4 side chain in its molecule. Concerning the low expression of the C18S mutant on the plasma membrane, it can be concluded that it was due to its internalization rather than to an impaired transport of the mutant from the endoplasmic reticulum to the cell membrane surface, since the pre-treatment with AT1 receptor antagonist was capable to revert the basal activity of the receptor. Indeed, the low basal levels of IP3 and [Ca2+]i were recovered and the responses to AngII were increased to the level of that found in the WT receptor. The hypothesis for a lack of maturation of the mutant receptor was ruled out since calnexin, the endoplasmic reticulum marker was poorly co-localized with C18S receptor. Therefore, our results suggest that the mutant receptor assumed a conformational structure similar to that of active mode of the AT1 receptor, favouring its internalization even in the absence of the agonist.

Martin, Renan Paulo. Identificação de diferentes modos de ligação do domínio N-terminal da angiotensina II com receptores AT, selvagem e mutantes. [Identification of different binding modes of N-terminal end of angiotensin II with wild type and mutant AT1 recptors]. Orientadora: Suma Imura Shimuta. São Paulo: s.n, 2009. [113]. Dissertação(Mestrado em Ciências)-Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Recebida em janeiro/2010. Resumo: Objetivos: Determinar os níveis de expressão dos receptores AT1 endógeno e exógeno nas células da musculatura lisa vascular de coelho transfectadas com o cDNA do receptor AT1 de rato para investigar uma correlação com o fenômeno de taquifilaxia induzida pela [Lys2 ]-AngII nessa linhagem de células; Investigar as propriedades de ligação do receptor AT1 com mutação da Cys18 por Ser, aos agonistas AngII, [Sar 1 ]- AngII e [Lys2 ]-AngII; Investigar a possível causa da predominância intracelular do receptor mutado C18S, utilizando antagonistas para reversão da internalização constitutiva e teste de maturação do receptor com calnexina. Métodos: Foi utilizado PCR em tempo real para determinar a expressão dos receptores AT1 endógeno e exógeno nas duas linhagens estudadas; a avaliação das propriedades de ligação do receptor mutante C18S foi baseada em ensaios de competição com radioligantes 3 H- AngII ou 125 I-AngII, utilizando os agonistas AngII, [Sar 1 ]-AngII e [Lys2 ]-AngII como ligantes frios, não marcados; para testar a hipótese de internalização constitutiva, células expressando o mutante ou o receptor selvagem foram tratadas com antagonistas do receptor AT1 e em seguida determinado-se os níveis de IP3 formado e alterações nas concentrações intracelulares de Ca2+ em condições de repouso e em resposta a concentrações crescentes de AngII e [Sar 1 ]-AngII. Para avaliar a hipótese da falta de maturação, foi realizada a imuno-marcação da calnexina, uma chaperona molecular envolvida na correta maturação de proteínas. Esta em seguida foi examinada para a sua co-localização com o receptor AT1 selvagem ou mutante, ambos marcados com GFP. Resultados e conclusões: Foi possível verificar que a mudança no comportamento das células que expressam o receptor exógeno, tornando-se taquifiláticas à [Lys2]-Angii enquanto a linhagem só expressando o receptor endógeno era taquifilática especificamente para a Angii, foi devido ao fato que o receptor exógeno foi cerca de 200.000 vezes mais expresso que o endógeno. Essa superexpressão pode ser atribuída à ubiquitina, vetor usado na expressão do receptor AT1 exógeno. Na segunda abordagem do trabalho, verificou-se que houve alterações nas propriedades de ligação do receptor mutado C18S. Esse mutante com a quebra da ponte S-S (Cys18 e Cys274) apresentou maior afinidade à [SAR 1]-AngII do que à AngII enquanto ocorreu completo impedimento na sua ligação à [Lys2 ]-AngII. Esses resultados foram observados quando a 3 H-AngII foi utilizada como traçador radioativo. Por outro lado, quando 125 I-AngII foi empregada, a ligação desse radioligante foi drasticamente inibida, impedindo assim a determinação dos parâmetros de ligação da AngII e dos análogos com o receptor mutado. Os resultados obtidos com a 3 H-AngII sugeriram que a quebra da segunda ponte levou o receptor a uma estrutura mais aberta, favorecendo a ligação da [Sar 1 ]-AngII que interage diretamente com a alça EC-3, do que com a AngII que interage inicialmente com a região N-terminal para depois interagir com a alça EC-3. Entretanto no caso da 125 I-AngII cuja ligação com o receptor AT1 selvagem foi normal mas foi impedida pela mutação C18S, pode estar relacionada com um modo de interação diferente apresentado pela 125 I-AngII devido a iodação no seu resíduo Tyr 4 . Com relação à alta expressão do receptor mutado na região Peri-nuclear do que na membrana plasmática, a observação que o tratamento das células com os antagonistas do receptor AT1 alterou a expressão funcional, demonstrada pela reversão na produção de IP3 e na regulação de [Ca2+]i, reforçou a hipótese da internalização constitutiva. Essa conclusão foi corroborada pela falta de co-localização do receptor ligado ao GFP a calnexina, indicando que o receptor não sofreu falta de maturação, uma das hipóteses que explicaria a maior presença intracelular do mutante. Portanto a internalização do receptor parece ser a causa mais provável para a predominância do receptor na região Peri-nuclear e essa internalização constitutiva pode estar associada à mudança na estrutura do receptor AT1 que passou a assumir aquela mais parecida com a forma ativada do receptor mesmo na ausência do ligante