Tese de doutorado
Função do metal bivalente na RNA Trifosfatase de Trypanosoma cruzi
Fecha
2006-01-01Registro en:
KIKUTI, Carlos Massayuki. FUNÇÃO DO METAL BIVALENTE NA RNA TRIFOSFATASE DE TRYPANOSOMA CRUZI. 2006. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, 2006.
Restrito-200600015.pdf
Autor
Kikuti, Carlos Massayuki
Institución
Resumen
Cap triphosphatases act in the first step of the mRNA capping process, removing the -phosphoryl group from the 5´ end of nascent RNA. Enzymes from trypanosomatids and other lower eukaryotes depend on metals for this catalysis. This contrasts with the cysteine-dependent activity of the corresponding enzymes of mammals. This difference points to these enzymes as potential targets for drug design. This dissertation describes the identification, expression, purification, enzyme kinetics, crystallization trials and the role of divalent metal in the ATPase activity of the cap triphosphatase from Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas´ disease. The properties of this enzyme are compared to the homologue enzymes previously characterized from Trypanosoma brucei and Saccharomyces cerevisiae. Similarity among those sequences indicates that the triphosphatase from T. cruzi has a tunnel domain containing the divalent metal forming its active site, as the enzyme from S. cerevisiae, whose structure was solved by crystallography and X-ray diffraction. Based on data from enzyme kinetics, circular dichroism, and intrinsic fluorescence analysis, a kinetic mechanism for the ATPase activity of the T. cruzi tunnel triphosphatase is proposed. A single metal interacts with the enzyme through the formation of a productive MnATP-enzyme complex, while free ATP inhibits activity. Manganese is also required for the tunnel stability of the T. cruzi enzyme, while the T. brucei homologue remains stable in the absence of metal, as shown for other triphosphatases. These findings may be useful to devise specific inhibitors for the T. cruzi RNA triphosphatase. As RNA trifosfatases agem no primeiro passo da formação do cap de RNA mensageiro, removendo o grupo -fosforil do terminal 5´ do RNA nascente. Enzimas de tripanosomatídeos e outros eucariotos inferiores dependem de metais para esta catálise. Em contraste, em plantas e metazoários essa atividade é dependente de um grupo tiol. Esta diferença faz com que as trifosfatases de protozoários e fungos patogênicos sejam potenciais alvos para o desenho de drogas específicas. Esta dissertação de doutorado descreve a identificação, expressão, purificação, tentativas de cristalização, caracterização cinética e a função do metal bivalente na atividade de ATPase da RNA trifosfatase de Trypanosoma cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas. Estas propriedades são comparadas com as enzimas homólogas previamente caracterizadas de Trypanosoma brucei e de Saccharomyces cerevisiae. A similaridade entre as seqüências destas enzimas indica que a trifosfatase de T. cruzi possui um domínio em forma de túnel que compõe o sítio ativo e contém o metal bivalente, assim como a enzima de S. cerevisiae, cuja estrutura foi resolvida por cristalografia e difração de raios X. Baseado em dados de cinética enzimática, dicroísmo circular e análises de fluorescência intrínseca, é proposto um mecanismo cinético para a atividade de ATPase da trifosfatase de T. cruzi. Neste, um único metal interage com a enzima através da formação do complexo produtivo MnATP-enzima, enquanto que ATP livre inibe a atividade enzimática. A estabilidade do túnel da trifosfatase de T. cruzi depende da presença de manganês, diferentemente das outras trifosfatases em túnel. Estas descobertas podem ser úteis para se desenvolverem inibidores específicos para a enzima de T. cruzi.