Estudo morfofuncional das células de Sertoli de ratos albinos tratados com etoposide na fase pré-púbere

Abstract

Spermatogenesis is a complex and controlled process in which Sertoli cells play a key role. In the testis, endocrine, paracrine and autocrine mechanisms that control spermatogenesis occurrence. The Sertoli cells synthesize substances which are essential for these mechanisms. Among them is transferrin. This protein is an important iron transporter that binds Fe+3 ions and transports them to cells via receptor-mediated endocytosis. It has been demonstrated that testicular transferrin constitutes 5% of all proteins secreted by Sertoli cells. In addition, it is a reliable instrument of investigation of the function and maturity of these cells, both in vitro and in vivo (Holmes et al., 1982; 1984). Tranferrin secreted by Sertoli cells is internalized by germ cell lineage through receptor-mediated endocytosis. It was recently demonstrated that, in addition to transport iron, transferrin exert antiapoptotic activity through Fas/FasL route, shows high antioxidant activity and play important role against reactive oxygen species (ROS). Although the Sertoli cells are considered the most resistant cell in the testis, they can be affected by germ cell damage or death. Studies showed that after apoptotic germ cell death, caused by gamma irradiation, Sertoli cell function is harmed. Apoptosis is responsible for germ cell number in the seminiferous epithelium under normal and adverse conditions. In normal conditions, apoptosis controls the number of germ cells that Sertoli cells are able to support. In addition to radiation, other adverse situations can interfere with germ cell apoptosis frequency. Chemotherapic drugs, e. g., provoke accentuated increase of germ cell apoptosis in the testis. Spermatogonia and primary spermatocytes are the main target of these drugs, because they undergo continuous mitosis and meiosis, respectively. Etoposide is an efficient chemotherapeutic drug administered against a large variety of malignant neoplasms. However, in spite of its beneficial effects against cancer, some reports have emphasized its toxicity, such as myelotoxicity and loss of fertility, on mammal. In fact, this drug might cause germ cell apoptosis and consequent severe depletion of seminiferous epithelium may occur in post-treated patients. Studies have shown that Sertoli cells play key role in etoposide action in the testis, because these cells express MRP1, a protein located in their basal plasma membrane. This protein functions as a bomb, which transports drugs, that entered Sertoli cells, back to the extracellular compartment. Furthermore, in addition to germ cell death, we observed a significant increase of numerical density of the Sertoli cells occurred in 64 day-old rats treated with etoposide in prepubertal phase. This phenomenon was surprising, since etoposide is mainly known to interfere with topoisomerase II, an important enzyme engaged in DNA replication and particularly abundant in cells undergoing rapid division; otherwise, this phenomenon does not normally occur in Sertoli cells at the studied age. Thus, based on Sertoli cell number alteration observed in our recently published work and considering the controversy about the action of the chemotherapeutic drugs on Sertoli cells, we decided to investigate Sertoli cell function and morphology in rats treated with etoposide during the prepubertal phase to assess a possible direct action of etoposide on Sertoli cells. Prepubertal 25 day-old albino Wistar rats were treated with the total dose of 40mg/Kg of etoposide. This dose was fractioned in eight doses of 5mg/Kg/day, which were administered during eight consecutive days. In this study we also investigated a possible cytoprotector action of iron-free transferrin (apotransferrin) on seminiferous epithelium. Thus, three apotransferrin doses were utilized: 0.1mg, 0.5mg and 1.0mg. Apotransferrin was administered: 24h before etoposide treatment beginning (i.e., when rats were 24-day-old), 30 minutes before each etoposide injection and 24h after the last etoposide injection. Thus, the rats were distributed in 14 groups: six treated only with etoposide; five controls treated with 0.9% saline solution; three treated with etoposide + apotranferrin. The control groups and five groups treated only with etoposide were sacrificed in different periods after the end of the treatment: 12h and 13, 32, 95 and 148 days. Each of these groups was composed by 13 rats; the testes of 10 rats were removed, processed for inclusion in paraffin and submitted to intratesticular transferrin labeling and to PAS+H method for Sertoli cell function and morphology, respectively. The testes of the other three rats were perfusion-fixed with 2.0% formaldehyde + 2.5% glutaraldehyde solution for ultrastructural analysis of Sertoli cell morphology under transmission electron microscope (TEM). The last group treated only with etoposide and the groups treated with etoposide + apotransferrin had five rats each and were sacrificed when they were 64-day-old. This age was chosen for transferrin protection investigation because, at this age, the rats showed the most accentuated alterations in the seminiferous epithelium after etoposide treatment. These rats were sacrificed and their testes were processed for paraffin embedding and stained with PAS+H for histopathological and morphometric analyses. In the control groups, accentuated transferrin labeling in the seminiferous epithelium was observed. In general, the etoposide-treated groups showed accentuated reduction of transferrin labeling in the seminiferous epithelium. This reduction caused diminution of volume density of transferrin labeled testicular tissue in all groups, except for the prepubertal. There was no difference in the interstitial tissue transferrin labeling among control and etoposide-treated groups; all groups showed accentuated labeling of this tissue. These data indicate that etoposide provoked alteration of Sertoli cell function, causing reduction of transferrin synthesis by this cell. However etoposide did not affected global transferrin production. During analysis under light microscope, morphological alteration of Sertoli cell nuclei were observed in the etoposide-treated groups; these cells did not show evident nucleoli. Sertoli cell nuclei in the tubular lumen were also observed. The analysis under TEM confirmed that etoposide causes accentuated Sertoli cell morphological alteration in all etoposide-treated groups. Some Sertoli cells showed degenerative characteristics and other cells showed morphological features of immature Sertoli cells, which were not compatible with the studied ages. All the morphological alterations observed in this study suggest the etoposide exert activity directly on Sertoli cell. This study also showed that, under the experimental conditions here utilized, apotransferrin did not protect the seminiferous epithelium against harmful effects of etoposide.

A espermatogênese é um processo altamente complexo e minuciosamente controlado por uma série de mecanismos bioquímicos e hormonais. No testículo, uma série de mecanismos endócrinos, parácrinos e autócrinos fornecem um microambiente adequado para a ocorrência da espermatogênese. A célula de Sertoli exerce papel fundamental nestes mecanismos através da síntese de substâncias essenciais para a espermatogênese. Dentre elas, está a transferrina que é a proteína secretada em maior quantidade por esta célula. Esta proteína é responsável pelo carreamento de íons triférricos (Fe3+) destinados às células da linhagem germinativa e representa um dos melhores marcadores da função das células de Sertoli. Foi demonstrado recentemente que a transferrina é dotada de atividade antiapoptótica atuando na via Fas/FasL da apoptose causada, além de apresentar alto poder antioxidante e atua na defesa do organismo contra espécies reativas de oxigênio (EROs). Embora as células de Sertoli sejam consideradas as mais resistentes do epitélio seminífero, elas podem sofrer alterações quando as células germinativas são danificadas ou quando há morte destas células. A apoptose é um tipo de morte celular programada que funciona como um meio controlador do número de células germinativas que as células de Sertoli são capazes de sustentar. São inúmeros os fatores que podem atuar diretamente sobre as células da linhagem germinativa, provocando morte apoptótica dessas células. Dentre estes agentes podem ser citados e os quimioterápicos. Nos testículos, as espermatogônias e os espermatócitos primários são os principais alvos dos quimioterápicos, pois são células em constante atividade mitótica e meiótica, respectivamente. O etoposide é um quimioterápico semi-sintético derivado da podofilotoxina, largamente utilizado em diversos programas de quimioterapia, inclusive em oncologia pediátrica. Sabe-se que este quimioterápico é dotado de comprovado potencial indutor de morte das células germinativas por apoptose. Alguns estudos demonstraram que a célula de Sertoli exerce papel fundamental na atuação do etoposide sobre o epitélio seminífero através da expressão de proteínas de membrana que funcionam como uma bomba, transportando a droga para fora da célula e impedindo que ela atinja as células alojadas no compartimento adluminal. Estudos prévios realizados por nosso grupo, os quais utilizaram ratos tratados durante a fase pré-púbere mostraram que o etoposide é um potente agressor testicular, causando acentuada diminuição da altura do epitélio seminífero, do diâmetro tubular e morte das células germinativas, por apoptose. Além dos danos às células germinativas, alterações numéricas das células de Sertoli também foram observadas, o que estimulou o estudo mais aprofundado dos efeitos do tratamento com o etoposide sobre os testículos de animais pré-púberes no que diz respeito à célula de Sertoli. Para a investigação da ação do etoposide sobre as células de Sertoli, ratos pré-púberes com 25 dias de idade foram tratados com a dose total de 40mg de etoposide por quilograma de peso corpóreo. Esta dose foi fracionada em 8 doses de 5mg/Kg diárias. Neste estudo investigouse também a possível ação protetora da transferrina sobre o epitélio seminífero: para isto, três doses diferentes de transferrina livre de ferro (apotransferrina) foram administradas 24h antes do início do tratamento com etoposide, 30 min antes de cada injeção diária desta droga e 24h depois do fim do tratamento quimioterápico. Desta forma, os animais foram distribuídos em 14 grupos: 6 tratados somente com etoposide, três tratados com etoposide + transferrina e cinco controles, que receberam solução fisiológica. Os grupos controles e cinco dos seis grupos tratados somente com etoposide foram sacrificados em diferentes períodos após o fim do tratamento: 12h e 13, 32, 95 e 148 dias. Cada um destes grupos constou de 13 animais: os testículos de 10 animais foram retirados, processados para inclusão em parafina e submetidos à marcação da transferrina intratesticular e à técnica histoquímica PAS + H para investigação, respectivamente, do estado funcional e da morfologia das células de Sertoli. Os três animais restantes de cada um destes grupos foram submetidos à perfusão via cardíaca com uma solução de glutaraldeído 2,5% + formaldeído 2,0% e tiveram os testículos retirados e processados para análise ao microscópio eletrônico de transmissão, com o objetivo de investigar a morfologia das células de Sertoli. O grupo restante dentre os tratados somente com etoposide e os grupos tratados com etoposide + transferrina constaram de 5 animais cada. Estes animais foram sacrificados aos 64 dias de idade. Esta idade foi escolhida para investigar a possível proteção do epitélio seminífero pela transferrina porque, nesta idade, este epitélio apresentou as mais acentuadas alterações após tratamento com etoposide. Após o sacrifício, os testículos destes animais foram processados para inclusão em parafina e submetidos à técnica histoquímica PAS + H para posterior análise histopatológica e morfométrica. Nos grupos controles, acentuada marcação de transferrina foi observada no epitélio seminífero. No geral, os grupos tratados com etoposide apresentaram acentuada redução da marcação da transferrina no epitélio seminífero. Esta redução fez com que a densidade de volume de tecido testicular marcado nos grupos tratados com etoposide também fosse diminuída, exceto pelo grupo pré-púbere E32. O tecido intersticial foi fortemente marcado tanto nos grupos controles, como nos tratados com etoposide, não havendo diferença na marcação deste tecido entre estes grupos. Estes dados indicam que o etoposide atuou sobre a função da célula de Sertoli, causando redução da síntese de transferrina por esta célula, mas não alterou a secreção global de transferrina. Durante a análise das células de Sertoli ao microscópio de luz, alterações morfológicas e de posição nucleares como não evidenciação do nucléolo e presença de núcleos na luz tubular. A análise ao microscópio eletrônico de transmissão confirmou que o etoposide causou acentuadas alterações morfológicas das células de Sertoli em todas as idades analisadas. Algumas células apresentaram características degenerativas e outras mostraram características de células imaturas, incompatíveis com as idades analisadas. As alterações morfológicas observadas sugerem que o etoposide, além de atuar noas espermatogônias e espermatócitos, pode agir diretamente sobre as células de Sertoli. Neste estudo observou-se também, que, nas condições experimentais aqui utilizadas, a apotransferrina não foi capaz de proteger o epitélio seminífero contra os efeitos deletérios do etoposide.