Estudo da isoforma da enzima conversora de angiotensina I(ECA) de 90kDa, potencial marcador genético da hipertensão: estudo funcional no modelo experimental de transplante renal

Abstract

Post-transplant hypertension is the most important risk factor for kidney disease progression and cardiovascular disease. 80/90 kDa ACE was detected in urine from spontaneous hypertensive rats (SRH) and was described as a possible genetic marker for hypertension. On previous work form our group, we characterized this enzyme in various tissues including heart, liver, adrenal, pancreas, and lung. The aim of this study was to evaluate whether this genetic marker for hypertension migrates from cells present on the graft (kidney from SHR, transplanted to normotensive Wistar rat) to the other tissues, including native kidney (kidney not manipulated from Wistar rat). Wistar rats were transplanted, and received a kidney form SHR (transplant-group) or from themselves (Sham-control group). After surgery, a group of transplanted animals were treated with cyclosporine (CsA, transplant CsA) for 15 and 30 days, and a second group did not receive drug treatment (transplant, no CsA). On 24-hour urine, we analyzed: ACE activity using Z-Phe-His-Leu as substrate and protein expression of ACE isoforms, particularly 80/90 kDa isoform using Western Blotting and the monoclonal antibody 9B9, specific for N-domain terminal. After the end of treatment, animals were sacrificed and tissues were excised to analyze the expression of ACE isoforms by Western Blotting, immunohistochemistry and amino-acid sequencing. In urine from transplantgroup treated with CsA, we detected the 80/90 kDa isoform of ACE, but not in urine form Sham-control group. On tissue evaluation by Western Blotting (native kidney, transplanted kidney, adrenal and lung) it was possible to detect the expression of 80/90 kDa isoform of ACE on transplant-group treated or not with CsA, whereas it was not detected in tissues form Sham-control group. Tissue ACE activity and blood pressure were increased on transplant-group not treated with CsA, as compared with animals treated with CsA and Sham-control group. These results were similar to those from immunohistochemistry where it was shown an intense expression of ACE on the group that did not received CsA treatment. Amino-acid sequencing of the band correspondent to ACE isoform with 80/90 kDa from kidney and lung, showed 75-95% homology with rat, human, mice and bovine ACE. Results suggest that transplanted kidney from SHR to Wistar animals induced the expression of 80/90 kDa ACE isoform both in urine and on analyzed tissues. The amino-acid sequencing of the 80/90 kDa proteic band showed a correspondence with ACE. Blood pressure and ACE activity were increased on native kidney and lungs from transplant-group not treated with CsA, suggesting that kidney transplant from hypertensive to normotensive animals transfers the genetic message, 80/90 kDa ACE, to the different tissues and this could cooperate for the development of hypertension caused by the migration of this molecule, via a phenomenon called microquimerism. The treatment with CsA alters enzymatic activity, and interferes somewhat on physiopathology of hypertension.

A hipertensão pós-transplante é o fator de risco mais importante para a progressão da doença renal, bem como para doenças cardiovasculares. A ECA de 80/90 kDa, detectada na urina de ratos espontaneamente hipertensos (SHR), foi descrita como um possível marcador genético de hipertensão. Esta enzima, em trabalhos anteriores de nosso grupo, foi caracterizada em vários tecidos do rato SHR. O objetivo deste estudo é avaliar se o marcador biológico da hipertensão (a ECA de 90/80 kDa) migra das células presentes no enxerto do rim do rato SHR transplantado no rato normotenso (Wistar) para outros tecidos, incluindo o rim nativo (rim não manipulado do rato Wistar). Os ratos Wistar foram transplantados, recebendo o rim dos ratos SHR (grupo transplante) ou dele próprio (grupo Sham-controle). Logo após a cirurgia, um grupo de ratos transplantados foi tratado com ciclosporina (CsA, transplante CsA) por 15 e 30 dias. Um segundo grupo não recebeu o tratamento (transplante sem CsA) no mesmo período. Na urina de 24 horas coletada dos animais dos diferentes grupos, foi analisada: a atividade da ECA total utilizando Z-Phe-His-Leu como substrato, e a expressão protéica das isoformas da ECA, em especial a enzima de 80/90 kDa por Western Blotting utilizando anticorpo monoclonal 9B9 contra ECA, específico para a porção N-domínio. Após o término do tratamento, os animais foram sacrificados e os tecidos foram retirados para posterior análise da expressão das isoformas da ECA por Western Blotting, imunohistoquímica e seqüenciamento.Na urina, a isoforma de 80/90 kDa foi detectada no grupo transplante com CsA, estando ausente no grupo Sham. Nos tecidos avaliados por Western Blotting, rim nativo, rim transplante, adrenal e pulmão foi possível observar a expressão da isoforma de 80/90KDa no grupo transplante com e sem CsA, não sendo detectada nos tecidos do grupo Sham. A atividade da ECA, nos tecidos analisados, foi maior nos ratos transplantados sem CsA, quando comparada ao grupo dos ratos tratados com CsA e o Sham, respectivamente. A pressão arterial média de cauda se mostrou elevada no grupo não tratado com CsA (s/CsA) quando comparado ao grupo tratado (CsA) e ao Sham. Estes resultados se repetiram na imunohistoquímica com uma intensa expressão da ECA no grupo transplante que não recebeu o tratamento com CsA. O seqüenciamento da banda protéica correspondendo à isoforma de 80/90 kDa do tecido renal e pulmonar demonstrou que esta é ECA homóloga às enzimas de rato, humana, de camundongo e bovina com uma homologia que varia entre 75 a 95%. Os resultados sugerem que o rim transplantado do rato SHR no Wistar promoveu o aparecimento da isoforma de 80/90 kDa tanto na urina como nos tecidos analisados. O seqüenciamento comprovou que a banda protéica de 80/90 kDa nos tecidos avaliados é ECA. A atividade da ECA e a pressão arterial foram maior no grupo não tratado com CsA no rim nativo e no pulmão do receptor normotenso, sugerindo que o transplante do rim hipertenso no rato normotenso promoveu a transferência da mensagem gênica, ou seja, da ECA com 80/90 kDa para os diferentes tecidos, que poderia estar cooperando para esse quadro hipertensivo, devido a uma migração desta molécula por um fenômeno que podemos definir como microquimerismo. O tratamento com CsA interfere na atividade enzimática, refletindo de alguma forma no mecanismo fisiopatológico sistêmico da pressão arterial. Financiado pela FAPESP.