Caracterização molecular de recombinantes intersubtipos do vírus da imunodeficiência humana tipo 1(HIV-1) em pacientes provenientes da epidemia do estado de São Paulo

Abstract

The extensive HIV-1 genetic diversity has several implications on the viral adaptive and evolutionary capabilities. This diversity is due to intensive mutational rates derived from error-prone activity of viral reverse transcriptase and RNA genomic instability, generating a highly diverse and heterogeneous viral population named quasispecies. However, even this intensive genetic variability passes through drastic genetic variants decrease events that decreases the numbers of viruses less adapted to the host pressures, bringing about a constant oscillation of the viral genetic characteristics within a population. Besides mutational events, there is the possibility that intra and intersubtype genomic recombination events can favor the generation of genetic diversity, making viruses capable of overcoming selective pressures.. The proposal of the study was to analyze molecular characteristics of HIV-1 intersubtype recombinants from São Paulo State epidemics, Brazil, in order to evaluate if the recombination events and recombination-derived population genetic fluctuation can influence the evolution of the infection in in vivo conditions. To do so, eleven newly-infected individuals with intersubtype recombinant viruses (based on full-length genome sequencing by bulk PCR) were selected and had their PBMCs samples collected each three months, during a one year and three months period, so that a prospective proviral load, viral load and CD4+ T cells count follow-up was performed. The analysis of the evolution patterns on laboratory parameters showed a significant variation between individuals, without any substantial difference between recombinant infection and pure clade infection. Moreover, proviral DNA samples relative to each three-month period (called visit) were amplified and had their protease-region restriction patterns mapped, showing that from 10 supposed recombinants 20% were, in fact, cases of double infections by pure B and F1 clades, these data being consistent with the double infections prevalence sub-estimation in São Paulo State. Following that, 1,2 kb pol fragments (including protease and part of reverse transcriptase) of each visit from individuals infected with both intersubtype recombinants and double infections were cloned, selecting ten clones from each condition for fragment sequencing and recombination breakpoints mapping. We observed that the visit one (V1) viral recombination breakpoints on the referred fragment were not seen on the further visits clones, and most of the 3´ end breakpoints persisted on the viral population through the observation period. Furthermore, the viral genetic diversity tended to be bigger on patients where there were recombination events.

A elevada diversidade genética do HIV-1 tem profundas implicações sobre as capacidades adaptativa e evolutiva virais. Essa diversidade é fruto da intensa taxa mutacional derivada da atividade errônea da transcriptase reversa e da instabilidade característica de genomas compostos por RNA, ocasionando no surgimento de uma população altamente diversa e heterogênea denominada quasispecies. Contudo, mesmo a intensa variabilidade genética caracterizada pelo modelo populacional do HIV-1 sofre eventos de redução drástica das variantes genéticas menos adaptadas às pressões seletivas do hospedeiro e entre os próprios vírus dentro da população, acarretando em uma oscilação constante das características genéticas virais em uma população. Além dos eventos mutacionais, existe a possibilidade de que os eventos de recombinação genômica intra e intersubtipos virais possam favorecer ainda mais a geração de diversidade genética, capaz de superar as pressões seletivas. A proposta desse estudo foi analisar as características moleculares de recombinantes intersubtipos do HIV-1 provenientes da epidemia do Estado de São Paulo, Brasil, de forma a avaliar se os eventos de recombinação e a flutuação genética populacional derivada destes eventos influenciavam a evolução da infecção na condição in vivo. Para tanto, 11 pacientes recentemente infectados por recombinantes intersubtipos (baseado no sequenciamento de genoma completo via bulk PCR) foram selecionados e tiveram suas amostras de PBMCs coletadas a cada 3 meses, durante um período de 1 ano de 3 meses, para que um acompanhamento prospectivo de suas cargas provirais, cargas virais e contagem de células T CD4+ fossem realizados. A análise dos padrões de evolução dos parâmetros laboratoriais significantes para a infecção pelo HIV-1 mostrou que os mesmos foram amplamente variáveis entre os pacientes, não havendo diferenças significativas entre os mesmos e infecções por subtipos puros. Além disso, as amostras de DNA proviral relativas a cada período de 3 meses (denominado visita) foram amplificadas e tiveram seus perfis de restrição na região da protease mapeados, constatando-se que de 10 supostos recombinantes 20% eram, na verdade, casos de infecção dupla por subtipos puros B e F1, dados esses que corroboram a subestimativa da prevalência de infecções duplas no Estado. Em seguida, os fragmentos de 1,2 kb da região de pol (incluindo protease e parte da transcriptase reversa) de cada visita de pacientes infectados por recombinantes e co-infectados foram clonados, sendo selecionados dez clones de cada ponto para seqüenciamento do fragmento e mapeamento dos breakpoints de recombinação. Observou-se que os breakpoints de recombinação relativos às amostras da primeira visita não mais ocorreram nos clones das demais visitas, sendo que a maioria dos breakpoints localizados na extremidade 3´ dos fragmentos sequenciados foram mantidos na população viral ao longo do período de observação. Ademais, a diversidade genética viral tendeu a ser maior nos pacientes onde foram verificados eventos de recombinação.H