Biossíntese de glicosaminoglicanos sulfatados: novos enfoques para o estudo de atividades e interações das enzimas do Golgi

Abstract

Heparam sulfato (HS) é um glicosaminoglicano altamente modificados (GAGs) ligados a um core proteíco, formando os proteoglicanos de heparam sulfato (HSPGs). A estrutura do HS é caracterizada por padrões de modificações específicas, dependendo do tipo celular, da idade e do organismo. A estrutura das cadeias de açúcar do HS são importantes na modulação da atividade dos HSPGs. A biossíntese do HS é conservada a partir de nematóides até o homem, iniciando no sistema retículo endoplasmático / cis-Golgi, onde uma ligação de tetrassacarídeo é adicionado a um resíduo de serina do core proteíco do proteoglicano. Após a adição covalente de um resíduo de xilose pela xilosil transferase, três diferentes enzimas adicionam os resíduos de galactose-galactose-ácido glucurônico, constituindo assim a região de ligação, sendo este último passo essencial para o complexo de polimerases EXT1 e EXT2 acrescentarem unidades alternadas de ácido glucurônico (GlcA) e glucosamina N-acetilada (GlcNAc) na região não-reduzida da cadeia. Após esta etapa de polimerização, um conjunto de modificações ocorrem: Ndesacetilação / N-sulfatação da GlcNAc pela enzima bifuncional, glucosaminil N-desacetilase / N-sulfotransferase, epimerização do ácido glucurônico adjacente ao recente domínio N-sulfatado pela glucuronosil C5 epimerase, e por fim, 2, 3 e 6-O sulfatação por diferentes sulfotransferases com distribuição tecido e isoformas específicas. A regulação dessas reações, bem como o mecanismo de sulfatação, são mal compreendidos. Além da evidência fragmentada, existe uma interrogação sobre a sistemática das interações bioquímicas da maquinaria biossintética do HS. N-Desacetilase-Nsulfotransferase 1 (Ndst1) promove a catálise inicial das modificações do HS e Heparina (Hep), removendo os grupos acetil das unidades de Nacetiglucosamina com subseqüente sulfatação dos amino grupos livres. Utilizando uma biblioteca de Phage Display, selecionamos com sucesso dois peptídeos que interagem especificamente com a Ndst1, inibindo sua atividade de sulfatação. Inibidores da maquinaria biossintética dos GAGs são importantes ferramentas para o estudo deste evento, bem como, na alteração da composição das cadeias de açúcar do HS em modelos in vitro. Ainda, utilizando as ferramentas de molecular docking e dinâmica molecular, fomos capazes de estudar com detalhe o sítio catalítico da NDST de origem humana e decifrar a relevância da precisão catalítica dos resíduos limitantes através da fenda hidrofóbica, bem como, a sua significância para o reconhecimento e sulfatação do glicano. Além disso, nós determinamos o resíduo de aminoácido essencial para a ligação ao hNDST, Finalmente, utilizando ambas tecnologias de identificação multidimensional da proteína e imunohistoquímica, fomos capazes de demonstrar inicialmente a presença e a localização tecidual dos diferentes proteoglicanos em diferentes órgãos do gastrópode Achatina fulica. A. Fulica é um modelo vital para a caracterização da especificidade e o modo de ação das enzimas envolvidas na biossíntese dos GAGs, pois a estrutura do GAG acaram sulfato, encontrado somente neste organismo, contradiz a atual teoria biossintética. Além disso, pela análise proteômica das proteínas isoladas do Golgi da A. fulica, bem como, a imunohistoquímica das secções dos tecidos, detectamos a presença da maquinaria de biossíntese dos glicosaminoglicanos. Portanto, este estudo busca elucidar a atividade da NDST, além de, fornecer novas técnicas e abordagens originais para o estudo da biossíntese dos GAGs.