Análise da expressão diferencial de genes por precursores neuronais e células da glia durante o desenvolvimento cerebelar pós-natal

Abstract

The role played by glial cells in the development of the central nervous system is not completely understood and the interaction of those cells with neurons is extremely important to the correct development of the brain. The purpose of this thesis was to identify genes differentialy expressed by neuronal precursors and glial cells during postnatal cerebellar development which could be related to the control of axonal outgrowth. Our results show that glial cells release soluble factors that stimulate axonal outgrowth by cerebellar granule cell precursors in an age-dependent manner. In order to identify candidate genes that could have their expression controlled by glial cells and could also be involved in the control of axonal outgrowth during the cerebellar development we used RDA (Representational Differential Analysis) to compare gene expression of neuronal precursors and glial cells from 3 and 9 days-old mice (P3 and P9). RNA extracted from P3 and P9 isolated granule cell precursors were reverse-transcribed into double-strand cDNA [(ds)- cDNAs]. The (ds)-cDNAs were digested using Sau3AI/Bsp143I and the fragments, called "representations", were used to produce subtractive libraries for each cell type. The libraries represented genes more expressed at P3 (forward library) and at P9 (reverse library). Using the cohesive ends generated by the digestion, adaptors were added to each end of the representations and three rounds of subtractive hybridizations were performed (1st round ratio 1:50; 2nd round ratio 1:200, and 3rd round ratio 1:500). By the end of the third round of subtractive hybridization, the differentialy expressed sequences were cloned into a pGEM-T Easy plasmid and DH5 bacteria were transformed with the vectors. The bacterial clones were selected and the inserts (representations) were sequenced. From sequencing we found two candidate genes, stmn1 which codes the protein stathmin1, in the forward library; and sept11 that codes septin11, in the reverse library. To validate the RDA results, we performed the quantification of the differentialy expressed genes by qRT-PCR. As expected, we found higher expression of sept11 in P9 neuronal precursors. On the other hand, there was no difference in stmn1 expression between P3 and P9 neuronal precursors. We also compared the expression of these genes in neuronal precursors treated with and without glial conditioned media. In P3 precursors, the treatment upregulated the expression of stathmin1 and did not change the expression of septin. In P9 neuronal precursors, both genes were downregulated. We also found the endogenous genes, -actin and GAPDH, to be downregulated, suggesting an inhibition of the global gene expression by the treatment. In consequence, it is possible that the downregulation observed for sept11 is a reflex of what is happening to the global gene expression. In conclusion, we have identified two candidate genes that are likely to be regulated in neuronal precursors and that the proteins they code for may participate in the events of early postnatal cerebellar development: stathmin1, involved in the organization of microtubules, and septin11, that plays an important role in cytokinesis and vesicular transport.

O papel desempenhado por células gliais no desenvolvimento do sistema nervoso central não é totalmente compreendido e a interação destas células com neurônios é extremamente importante para o correto desenvolvimento do cérebro. O objetivo desta tese foi identificar genes diferencialmente expressos por precursores neuronais e por células da glia durante o desenvolvimento cerebelar pós-natal que pudessem estar relacionados com o controle do crescimento axonal. Nossos resultados mostram que células da glia secretam fatores solúveis que estimulam o crescimento axonal de precursores de células granulares cerebelares de forma dependente da idade. Para identificar genes candidatos a ter sua expressão controlada por células gliais que estariam envolvidos no controle do crescimento axonal durante o desenvolvimento cerebelar utilizamos a técnica RDA (Representational Differential Analysis) para comparar a expressão gênica de precursores neuronais e células da glia de animais 3 e 9 dias de idade (P3 e P9). RNA extraído de precursores neuronais e de células da glia P3 e P9 foram reversamente transcritos em cDNA dupla-fita [(ds)-cDNAs]. Os (ds)-cDNAs foram digeridos por Sau3AI/Bsp143I e os fragmentos, denominados "representações", foram utilizados para produzir bibliotecas subtrativas para cada tipo celular. As bibliotecas obtidas representavam tanto genes mais expressos em P3 (biblioteca forward) quanto genes mais expressos em P9 (biblioteca reverse). Usando o terminal coesivo gerado pela digestão, foram adicionados adaptadores em cada extremidade das representações e três rodadas de hibridizações subtrativas foram realizadas (1ª rodada, razão 1:50; 2ª, 1:200; e 3ª, 1:500). Ao final da terceira rodada de hibridização subtrativa, o material diferencialmente expresso foi clonado em um plasmídeo pGEM-T Easy e bactérias DH5 foram transformadas com os vetores obtidos. As colônias foram selecionadas e os insertos (representações) foram sequenciados. A partir de sequenciamento encontramos dois genes candidatos, stmn1, que codifica para a proteína stathmin1, identificado na biblioteca forward; e sept11, que codifica para a proteína septin11, identificado na biblioteca reverse de precursores neuronais. Para validar os resultados da RDA, realizamos a quantificação dos genes diferencialmente expressos por qRT-PCR. Como esperado, encontramos maior expressão de sept11 em P9. Por outro lado, não houve diferença na expressão de stmn1 quando comparamos a quantidade de mRNA desse gene em amostras de precursores neuronais P3 e P9. Também comparamos a expressão destes genes em precursores neuronais com e sem tratamento com meio condicionado por células da glia. Em precursores neuronais P3, o tratamento causou aumento da expressão de stmn1 e não alterou a expressão de sept11. Em precursores neuronais P9, ambos os genes foram menos expressos quando as células foram expostas ao meio condicionado. No entanto, a expressão dos genes utilizados como controles endógenos, -actina e GAPDH, também estava diminuída, sugerindo uma inibição da expressão gênica global pelo meio condicionado por células da glia. Em consequencia disso, é possível que a diminuição observada para a expressão de sept11 seja um reflexo do que está acontecendo com a expressão gênica global. Em conclusão, identificamos dois genes candidatos que são susceptíveis de ser regulados em precursores neuronais e cujas proteínas que codificam podem participar dos eventos do desenvolvimento cerebelar pós-natal: stathmin1, envolvida na organização dos microtúbulos, e septin11, que desempenha importante papel na citocinese e transporte vesicular.