Detección e identificación molecular de Plasmodium spp en la amazonia ecuatoriana por la técnica de semi-nested multiplex PCR

Abstract

La malaria es causada por protozoarios del genero Plasmodium spp. Con 5 especies infectantes al hombre. En Ecuador, es endémica en regiones tropicales de la Amazonia y Costa. Las especies circulantes en el país son Plasmodium falciparum y P. vivax. Es Importante diagnosticar tempranamente y determinar la especie de Plasmodios, por el riesgo de desarrollar malaria complicada que podría ser fatal. El método de diagnóstico recomendado es la microscopía en frotis de sangre coloreadas con Giemsa, pero tiene baja sensibilidad, especificidad y poca certeza en la identificación de la especie. Por ende, la búsqueda de otros métodos de diagnóstico inmunológicos y moleculares es continúa. En el presente estudio se estandarizó una semi-nested multiplex PCR (SnM-PCR) con el objetivo de detectar y discriminar entre P. vivax, P. falciparum, P. malariae y P. ovale a partir de ADN extraído de placas de vidrio con frotis de sangre de pacientes sospechosos de malaria de la Amazonia. La extracción del ADN se realizó con Chelex-100. Se estandarizó la SnM-PCR. Método que se basa en la amplificación de las secuencias del gen 18S ribosomal (ssrARN). Este gen presenta varias copias y dominios para los 4 parásitos humanos de malaria. En la primera reacción de SnM-PCR utilizamos un cebador universal (UNR) y un directo (PLF) específico para Plasmodium. En la segunda reacción utilizamos el cebador directo y 4 cebadores inversos (VIR, FAR, MAR, OVR) específicos para P. vivax, P. falciparum, P. malariae y P. ovale; los amplicones esperados son 495pb, 395pb, 269pb y 436pb, respectivamente; con la finalidad de diferenciar entre especies. Estandarizada la técnica aplicamos en 649 frotis de sangre, 333 positivos y 316 negativos por microscopía. Los frotis fueron tomados de personas sospechosas de tener malaria, durante los años 2015 y 2016, en 5 provincias amazónicas del Ecuador. Al comparar con la microscopía, la SnM-PCR obtuvo 96 positivos de 333 microscopio-positivos y 19 positivos de 316 microscopio-negativos, demostrando sensibilidad del 28.8por ciento (Intervalo de confianza [IC] del 95 por ciento, 24.0 por ciento; 33.7 por ciento) y una especificidad del 94.0 por ciento (IC 95por ciento, 91.4 por ciento; 96,6 por ciento). Concerniente a la identificación de especies, 64-96 (67 por ciento) se identificaron como P. vivax y 32-96 (33 por ciento) como P. falciparum. Con la SnM-PCR se encontró que 12-52 (23.07 por ciento) de los casos identificados como P. vivax correspondían a P. falciparum y 5-8 (62.5 por ciento) identificados como P. falciparum eran P. vivax. Con nuestra técnica se encontró positividad en 36 frotis que carecían de identificación, con 19-36 (53 por ciento) correspondientes a P. vivax y 17-36 (47 por ciento) a P. falciparum. La técnica estandarizada en este estudio permitió la diferenciación entre P. vivax y P. falciparum, presentes en la Amazonia ecuatoriana. Además, fue posible la amplificación de ADN desde frotis de sangre coloreados y guardados por 12 y 24 meses, implicando la posibilidad de realizar estudios epidemiológicos retrospectivos. La extracción de ADN por Chelex y la mala calidad de la muestra en las placas mal almacenadas pudieron haber causado una baja sensibilidad en comparación con la microscopia. En el futuro se debería probar este método con otro protocolo de extracción de ADN y muestras frescas.