Regulación de la replicación del ADN en respuesta al estrés hipotérmico en saccharomyces cerevisiae

Abstract

Se han realizado varios estudios en cuanto al ciclo celular, muchos de ellos encaminados a comprender los mecanismos de regulación de la replicación y reparación del ADN. En este trabajo se utilizó a la levadura Saccharomyces cerevisiae como modelo para analizar la regulación de la replicación del ADN en respuesta al estrés hipotérmico. Se utilizaron diferentes cepas de S. cerevisiae que tienen deleciones en una o dos actividades enzimáticas de las rutas del checkpoint en la fase S del ciclo celular. Mediante el uso de técnicas microbiológicas se determinó el crecimiento de las diferentes cepas a 25°C y 4°C (drop test y curvas de crecimiento). Una vez establecido el tiempo de crecimiento de las diferentes cepas y su comportamiento a 4°C, se sincronizaron la cepa salvaje y las cepas mutantes con respecto a la fase S del ciclo celular para determinar si existían diferencias entre la replicación de ambas, se verificó el proceso mediante el análisis de muestras mediante citometría de flujo, medida de absorbancia a 600nm y monitoreo budding index. Posteriormente, se realizó electroforesis de campos pulsados (PFGE) con el fin de analizar el progreso de la replicación del ADN de la cepa salvaje y las mutantes dot1, hog1 y hog1 dot1; seguido de ello, se realizó Western Blot para observar la activación de Rad53, Hog1 y la metilación de la histona H3 a 25°C y 4°C. Los resultados obtenidos mostraron que la cepa salvaje es más sensible al estrés hipotérmico que la cepa dot1 (drop test). Así mismo, en la cepa salvaje se observó un paro en la replicación (PFGE). No se encontró activación de la proteína Rad53 a 4°C, contrario a la activación de Hog1 a la misma temperatura. Estos datos en conjunto sugieren que la respuesta al estrés hipotérmico está regulada por Hog1 y Dot1, independiente de la ruta dependiente de Rad53.