Identificación y diferenciación molecular por la técnica de la reacción de la cadena polimerasa (pcr) múltiple de subgéneros de leishmania (viannia y leishmania) en el Ecuador

Abstract

El protozoario del género Leishmania con varias especies ocasiona enfermedades denominadas leishmaniasis. El género Leishmania contiene dos subgéneros Leishmania y Viannia, que incluyen 21 especies patógenas para el hombre. En el Ecuador, se han identificado los 2 subgéneros con las especies L. mexicana, L. amazonensis y L. major (subgénero Leishmania); L. braziliensis, L. panamensis, L. guyanensis, L. naiffi y L. lainsoni (subgénero Viannia). Existe predominancia de especies de acuerdo a las regiones geográficas del país. Es conocido que diferentes subgéneros-especies determinan diferentes formas clínicas, así como diferencian el tratamiento y el pronóstico de la enfermedad. La técnica más usada para el diagnóstico de leishmaniasis es la identificación de las formas parasitarias amastigotes de Leishmania por microscopía de luz. Los métodos de caracterización e identificación de subgéneros y especies se basan en caracteres bioquímicos, inmunológicos y moleculares. Por microscopia es imposible diferenciar entre subgéneros debido a que estos organismos son morfológicamente idénticos. Las herramientas moleculares han demostrado utilidad para diagnosticar, caracterizar, tipificar, y cuantificar los agentes etiológicos. En la presente investigación, se ha realizado el diseño de una PCR múltiple con el propósito de diferenciar entre los subgéneros Leishmania y Viannia, se generó un análisis bioinformático mediante alineamientos múltiples de secuencias de marcadores moleculares con el fin de obtener secuencias consenso para los dos subgéneros. A partir de dicho análisis se determinó que los marcadores moleculares para la diferenciación fueron los genes cpb y nagA, coincidiendo con los reportes de otras investigaciones. Por medio de la selección de los genes, se procedió al diseño de cebadores discriminantes y posteriormente a la estandarización de una PCR múltiple. Como resultado, se obtuvo amplificaciones con los siguientes tamaños; una de 300 pb perteneciente a la amplificación parcial del gen nagA para la identificación del subgénero Leishmania y otro de 172 pb perteneciente a la amplificación parcial del gen cpb para la identificación del subgénero Viannia. Los resultados por PCR fueron respaldados por un análisis de secuenciación evidenciando la alta confiabilidad de la técnica. Ya estandarizada la técnica, se procedió a su aplicación en muestras humanas inmovilizadas en papel FTA provenientes de la Amazonía. La presente investigación permitirá la identificación precisa de los subgéneros en las lesiones de pacientes, así como la discriminación de vectores y reservorios. A futuro permitirá el desarrollo de otros proyectos enfocados a la distribución geográfica de dichos subgéneros.