Interação de Streptococcus mutans e de Candida albicans em biofilme in vitro

Abstract

O objetivo foi avaliar quais são os mecanismos de Streptococcus mutans e de Candida albicans que contribuem para aumentar a patogenicidade do biofilme misto. Biofilmes mistos e simples das cepas S. mutans UA159 (Sm) e C. albicans SC5314 (Ca) foram formados sobre discos de hidroxiapatita com película salivar, na presença de sacarose. O pH do meio de cultura foi aferido em diversas fases de desenvolvimento do biofilme. Após 43h de crescimento, foram realizadas análises bioquímicas (peso seco, proteinas, composição da matriz extracelular) e de população microbiana. A estrutura dos biofilmes foi avaliada por microscopia confocal em 19 e 43h. A expressão de genes de vias metabólicas de ambas espécies foi verificada em 28h. Os dados foram avaliados por métodos estatísticos considerando α=0,05. Verificou-se diferença do pH do meio para os três biofilmes nos tempos 19, 27 e 43h (p<0,001; ANOVA dois critérios, Tukey). Biofilmes de Sm e misto foram mais ácidos em 19 e 43h, enquanto biofilmes de Ca mantiveram o pH neutro (p>0,05). As quantidades do peso seco e de proteínas de biofilme misto foram maiores comparadas aos biofilmes simples, e menores para Ca (p=0,001; ANOVA um critério). Não houve diferença na quantidade de exopolissacarídeos solúveis entre biofilmes Sm e misto, porém o biofilme Ca apresentou menor quantidade (p<0,001; Kruskal-Wallis, Dunn). Houve maior quantidade de exopolissacarídeos insolúveis em biofilme misto (p=0,002). Verificou-se mesmo comportamento populacional para Sm em biofilmes mistos e simples (p=0,404; Mann Whitney); porém, para Ca o biofilme misto apresentou maior população versus o simples (p<0,001; Teste t). Em 43h, a estrutura tridimensional demonstrou microcolônias maiores em biofilmes mistos comparado à Sm, e ausência dessas estruturas em biofilme simples de Ca. Em biofilmes mistos, as células de Ca estavam localizadas ao redor de conjuntos de células de Sm. Ainda, a distribuição de exopolissacarídeos insolúveis derivados de exoenzimas de Sm foi diferente em biofilmes mistos e simples de Sm. Em 19h, a presença de polissacarídeos derivados de Ca foi melhor observado em biofilme simples de Ca comparada ao biofilme misto. Em 28h, a expressão dos genes de Sm gtfB (síntese de exopolissacarídeos insolúveis) e nox1 (estresse oxidativo) foi maior em biofilme simples de Sm (p≤0,021); não houve diferença para a expressão de atpD (estresse ácido). Para Ca, o nível de expressão dos genes de BGL2 e PHR1 (síntese de polissacarídeos), SOD1 (estresse oxidativo) também foi maior em biofilme simples (p≤0,043); e não houve diferença para PHR2 (estresse ácido). Assim, a fase em que a expressão gênica foi avaliada demostrou que biofilmes simples de ambas espécies apresentaram maior atividade metabólica em relação ao biofilme misto. Portanto, a associação de Sm e Ca resulta em maior complexidade funcional e organização tridimensional de biofilmes mistos (comparados à simples) via produção de exopolissacarídeos pelas duas espécies, mas principalmente por Sm.

The objective was to evaluate the mechanisms of Streptococcus mutans and Candida albicans that contribute to increasing the pathogenicity of the mixed-species biofilm. Mixed and single-species biofilms of the strains S. mutans UA159 (Sm) and C. albicans SC5314 (Ca) were formed on saliva-coated hydroxyapatite discs in the presence of sucrose. The pH values of the culture media were verified at distinct developmental phases of biofilms. After 43h of growth, the biofilms were subjected to distinct assays biochemical (dry weight, proteins, the composition of extracellular matrix) and microbiological (colony forming units), analyzes. The biofilm´s structure was verified via confocal microscopy at 19 and 43h. Gene expression of metabolic ways from both species was evaluated at 28h. The data were assessed by statistical methods (α=0,05). There was a difference in the media pH for the three biofilms at times 19, 27 and 43h (p<0,001; two-way ANOVA, Tukey). Sm and mixed-species biofilms were acidic at 19 and 43h, while Ca biofilms maintained a neutral pH (p>0,05). The amounts of dry weight and proteins were higher for mixed-species biofilm compared to single-species biofilms, being lower for Ca (p=0,001; one-way ANOVA). The quantity of soluble exopolysaccharides was similar for Sm and mixed-species biofilms but Ca presented a lower amount than those biofilms (p<0,001; Kruskal-Wallis, Dunn). There was a higher amount of insoluble exopolysaccharides in mixed-species biofilm (p=0,002). There was no difference in Sm population in single- and mixed-species biofilms (p=0,404; Mann Whitney); however, the mixed-species biofilm presents a higher population of Ca versus the single-species biofilm (p<0,001; t-Test). The three-dimensional structure analysis showed larger microcolonies in mixed-species biofilms versus Sm biofilm, and absence of these structures in Ca biofilm. In mixed-species biofilms, Ca cells were located around clusters of Sm cells. Also, distribution of exopolysaccharides was different in mixed-species and Sm biofilms, but this component was not present in Ca biofilms. The presence of Ca-derived polysaccharides was better observed in single-species biofilms (versus mixed-species biofilms). In 28h gene expression levels of Sm, gtfB (insoluble exopolysaccharides) and nox1 (tolerance to oxidative stress) were higher for Sm single-species biofilm (p=0,021; p<0,001); while there was no difference for atpD (tolerance to acid stress). The expression level of Ca genes BGL2 and PHR1(polysaccharides), and SOD1 (tolerance to oxidative stress) were also higher for Ca single-species biofilm (p=0,043; p=0,005; p<0,005); while PHR2 (tolerance to acid stress) was similar for both biofilms. Thus, the gene expression phase evaluated indicates lower metabolic activity in both single-species biofilms in comparison with the mixed-species biofilm, which presents higher amounts of metabolic products (e.g., insoluble exopolysaccharides). Therefore, the association of Sm and Ca results in greater functional complexity and three-dimensional organization of mixed-species biofilms (versus single-species biofilms) via production of exopolysaccharides by both species, primarily by Sm.