Avaliação da variabilidade do metabolismo secundário em Cordia verbenacea DC

Abstract

Cordia verbenacea DC. pertence à família Boraginaceae, a qual contém aproximadamente 100 gêneros com mais de 2.000 espécies. Ocorre ao longo de todo litoral brasileiro, sendo comum na Floresta Tropical Atlântica e possuindo vários nomes populares, sendo o mais comum erva-baleeira. É utilizada tradicionalmente para tratar vários processos inflamatórios. O laboratório Aché® desenvolveu um medicamento fitoterápico anti-inflamatório tópico à base do óleo essencial de C. verbenacea (Acheflan®) e a espécie está presente no Formulário Nacional de Fitoterápicos da Farmacopeia Brasileira. Considerando a relevância de estudos de variabilidade química para espécies medicinais e a ausência destes dados na literatura para C. verbenacea propomos realizar um estudo da dinâmica do metabolismo da espécie focado nas variações sazonal, circadiana e populacional. As folhas de C. verbenacea foram coletadas, secas, trituradas e submetidas à maceração com etanol (1:15 m/v). Posteriormente, foi realizada uma extração em fase sólida com o extrato etanólico seco obtendo-se 10 frações, as quais foram analisadas por CCD e CLAE-UV. A fração 4.1 foi escolhida para cromatografia em coluna originando 120 subfrações, das quais três estavam semipurificadas. Utilizando a técnica de CLAE preparativa foram purificadas quatro substâncias, sendo três obtidas com mais de 95 % de pureza (CLAE-UV). As substâncias foram analisadas por técnicas espectrométricas (UV, IV e RMN), sendo identificados os triterpenos cordialina A e cis-cordialina A e dois flavonoides, 4’,5-diidroxi-2’,3,5’,6,7-pentametoxiflavona ou 2’,5-diidroxi-4’,3,5’,6,7-pentametoxiflavona e a artemetina. Um método por CLAE-DAD foi desenvolvido e aplicado na análise dos extratos etanólicos dos estudos populacional, circadiano e sazonal, incluindo a obtenção de seus perfis cromatográficos e a quantificação das substâncias purificadas. Os estudos populacional, circadiano e sazonal evidenciaram diferenças quantitativas em relação as substâncias majoritárias após a análise cromatográfica, sendo a substância diidroxipentametoxiflavona encontrada em maior quantidade no espécimen 13II4 do estudo populacional, já no estudo circadiano o horário das 04:30 h apresentou maior rendimento e no estudo sazonal maior tendência de produção deste flavonoide no período de janeiro a março de 2015/2016, enquanto que para os triterpenos o espécimen 3IV1 apresentou maior rendimento no estudo populacional e os espécimens 2II5 e 3II5 maior rendimento no estudos circadiano e sazonal, sendo os períodos de março a maio de 2015 e janeiro a março de 2016 os de maior tendência de produção desses triterpenos. A análise quimiométrica evidenciou uma diferença quantitativa dos metabólitos não voláteis entre os espécimens. A análise estatística utilizando ANOVA evidenciou que o rendimento do extrato e o teor dos triterpenos e flavonoide são afetados pelos períodos do ano. Foram obtidos os óleos essenciais dos 27 espécimens do estudo populacional e dos sete espécimens dos estudos circadiano e sazonal. O teor de óleo essencial na droga vegetal e sua coloração (amarelo claro, amarelo, esverdeado e azul) variaram entre os espécimens analisados. A análise por CCD também evidenciou diferenças significativas entre eles. Os dados obtidos por CCD dos 27 espécimens do estudo populacional foram utilizados em análises por PCA e HCA, observando-se agrupamento dos espécimes de óleo de cor azul/esverdeados em relação aos demais óleos de cor amarela. Esses agrupamentos também foram verificados nas PCA e HCA obtidas com dados por CG-EM, evidenciando que a amostra do óleo essencial do espécimen 13I5 possui maior tendência de produção do trans-cariofileno e do α-humuleno. Os óleos de cor azul/esverdeados evidenciaram a presença de três substâncias específicas: elemeno, camazuleno e espatulenol. A análise estatística utilizando ANOVA evidenciou que o rendimento do óleo essencial e o teor de seus componentes são afetados pelos períodos do ano, mas não pelo ritmo circadiano.

Cordia verbenacea DC. belongs to the Boraginaceae family which contains about 100 genera with more than 2,000 species. C. verbenacea is popularly named erva-baleeira and occurs throughout the Brazilian coast including the Atlantic Rainforest. It is traditionally used to treat various inflammatory processes and was employed by Aché® laboratory for the development of Acheflan®, an anti-inflammatory topical medicine containing the essential oil of C. verbenacea. Considering the relevance of chemical variability studies for medicinal plants we propose to develop a study of the metabolism dynamics focused on seasonal, circadian and population variations. The leaves of C. verbenacea were collected, dried, crushed and macerated with ethanol (1:15 m/v). The solid phase extraction with ethanolic extract yielded 10 fractions which were analyzed by TLC and HPLC. Fraction 4.1 was selected for column chromatography yielding 120 subfractions. Four compounds were isolated using preparative HPLC-UV and three compounds presented high purity (≤95 %; HPLC-UV) and were analyzed by spectrophotometric techniques (UV, IR, NMR). Compounds were identified as the triterpenes cordialin A and cis-cordialin A and the flavonoides 4',5-dihydroxy-2',3,5',6,7-pentametoxiflavone or 2',5-dihydroxy-4',3,5',6,7-pentametoxiflavone and artemetin. An HPLC-DAD method was developed for the analysis of the ethanolic extract. The ethanolic extracts of seasonal, circadian and population studies were analyzed by HPLC-DAD. All these studies showed quantitative differences in relation to the majority compounds, being the substance dihydroxypentamethoxyflavone found in a larger quantity in specimen 13II4 of the population study, already in the circadian study the time of 04:30 h had a higher yield and in the seasonal study a greater trend of production of this flavonoid in the period from january to march of 2015/2016, while for the triterpenes the specimen 3IV1 presented higher yield in the population study and the specimens 2II5 and 3II5 greater yield in the circadian and seasonal studies, being the periods of march to may of 2015 and january to march of 2016 the ones of greater tendency of production of these triterpenes. The statistical analysis using ANOVA showed that the yield of the extract and the content of triterpenes and flavonoid were affected by the periods of the year. Essential oils were obtained from the 27 specimens from the population study and the seven specimens from the circadian and seasonal studies. The essential oil content in the plant drug and its color (light yellow, yellow, green and blue) differed among the specimens. The TLC analysis also showed significant differences among the oils. Data obtained by TLC analyzes of the 27 specimens of the population study were used in PCA and HCA analyzes that showed two groups of oils - blue / green oil specimens and yellow color oil specimens. These clusters were also verified in PCA and HCA obtained with GC-MS data, evidencing that the sample of the 13I5 of the specimen has a greater trend of production of trans-caryophyllene and α-humulene. The blue/green oils showed the presence of 3 specific compounds: elemene, camazulene and spatulenol. The statistical analysis using ANOVA showed that the yield of the essential oil and the content of its components were affected by the periods of the year, but not by circadian rythm.