Exploração do genoma de Phytomonas serpens

Abstract

O estudo de tripanosomatídeos de plantas teve início em 1909, quando foram encontradas formas flageladas em látex, sendo depois encontradas em floema, frutas e flores. Desde a refutada tentativa de Donovan de criar o gênero Phytomonas, temos atualmente, várias espécies classificadas dentro do gênero Phytomonas, incluíndo Phytomonas serpens, organismo alvo de nosso estudo. O ciclo de vida de P. serpens compreende planta e inseto. A transmissão é feita do tomate para inseto, do inseto para tomate. O vetor natural é o hemíptero Phthia picta (Hemiptera: Coriidae) que quando se alimenta de tomates infectados, se torna infectado após 10 a 15 dias, apresentando parasitos nas fezes, urina, tubo digestivo e glândulas salivares. Pouco se sabe sobre P. serpens e o conhecimento é ainda mais escasso se levarmos em conta todos os organismos dentro do gênero Phytomonas. O objetivo deste projeto é explorar o genoma de P. serpens gerando e analisando seqüências de seu genoma, aumentando o conhecimento deste organismo e comparando seu genoma com outros organismos. A cepa 9T de P. serpens (CT–IOC-174) foi cultivada a 27oC em meio Schneiders ́insect medium suplementado com 10% de soro fetal bovino. O DNA genômico foi extraído por lise alcalina para a construção da biblioteca genômica. O DNA foi parcialmente digerido com a enzima de restrição Sau3A. Os fragmentos de DNA com tamanhos entre 1-3 kb foram recuperados do gel de agarose e purificados. Os fragmentos de DNA foram clonados no sítio BamHI do vetor de clonagem pUC18. A reação de sequenciamento foi realizada na plataforma de sequenciamento ABI3730 – 48 capilar PDTIS/FIOCRUZ e na plataforma MegaBase na UERJ. Todas as seqüências foram armazenadas em banco de dados “open source” nos servidores Linux no Laboratório de Biologia Molecular de Tripanosomatídeos e Flebotomíneos (DBBM/IOC/FIOCRUZ). Foram seqüenciados 829 clones da biblioteca de DNA genômico obtendo-se um total de 379 seqüências GSS (Genomic Sequence Survey) de alta qualidade. Foram utilizadas para a complementação deste estudo, as seqüências do projeto EST de P. serpens que estavam disponíveis no GenBank. Os 221 clusters GSS e os 697 clusters de EST (Expressed Sequence Tag) foram comparados com o programa de busca de similaridade Blast a diferentes bancos de dados, utilizando como parâmetro evalue 10 -5, gerando 599 clusters com entradas positivas (Hits) e 303 clusters com nenhum hit, representando possíveis genes espécie específicos. Os clusters foram anotados de acordo com sua função quando comparados ao banco de dados Gene Ontology (GO) representando uma análise inédita no genoma de P.serpens. Inferências filogenéticas e de similaridade com o banco “Taxonomy” do NCBI foram realizados, usando inclusive seqüências do genoma ambiental, para verificar se as mesmas pertencem a Kinetoplastida, o que não se comprovou. As inferências filogenéticas realizadas com genes concatenados mostraram que P. serpens é mais próximo de T. cruzi, enquanto que inferências com genes individuais apontaram para L. major. Com base na literatura, inferimos que a análise da árvore de genes concatenados é correta. Foram encontradas com o GLIMMER 20 genes hipotéticos nas seqüências de GSS. Encontramos 22 cluters em GSS que não foram encontrados anteriormente em EST, como por exemplo, Piroglutamil-peptidase I, antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) e Peptidase_M8.