Produção de anticorpos IgY específicos para o vírus da hepatite A purificados de gema de ovo de frangas imunizadas e sua possível aplicação em diagnóstico do vírus no fígado

Abstract

O interesse da literatura científica pela imunoglobulina Y (IgY) é crescente devido a várias vantagens tais como: fácil obtenção, baixo custo, produção em larga escala e método mais adequado quanto ao aspecto bioético. A IgY esta presente em aves e répteis, sendo transferida do soro para a gema dos ovos desses animais através de processo secretório. A produção de imunoglobulina IgY específica contra o vírus da hepatite A se justifica na detecção do vírus da Hepatite A (HAV) em tecido hepático em casos de hepatite fulminante sem diagnóstico definido, em ensaios experimentais para preparação de novas vacinas para hepatite A e a possibilidade de emprego como imunoterapia na prevenção da hepatite aguda pós-exposição ao vírus. Cabe ressaltar que anticorpos anti-HAV atualmente comercializados têm baixa afinidade e têm custo elevado. Nosso estudo consistiu em produzir anticorpos específicos anti-HAV em frangas ISA Brown imunizadas e avaliar seu uso no diagnóstico da hepatite A em tecido. METODOLOGIA: Vinte galinhas divididas em cinco grupos (I-V) foram imunizadas com os seguintes inóculos: Grupo I – Vacina comercial contra hepatite A e Oligodesoxinucleotídeos contendo C-fosfato- guanosina (CpG-ODN); Grupo II – Vacina comercial contra hepatite A; Grupo III – Vírus da Hepatite A, adjuvante incompleto de Freund (IFA) e CpG-ODN; Grupo IV – Vírus da Hepatite A e IFA; Grupo V – IFA (controle). Os ovos foram coletados e purificados pelo método de precipitação em polietileno glicol (PEG). A IgY foi caracterizada e quantificada pelos métodos de ELISA, neutralização in vitro, eletroforese e “Western Blotting”. A detecção do HAV em fígado foi realizada pelo método de imunofluorescência indireta (IIF) com a IgY anti-HAV sendo utilizada como anticorpo primário e IgG de cabra anti-IgY marcada com Alexa Fluor® 488 como anticorpo secundário. Para isto utilizamos amostras de fígado de primatas não-humanos (macacos cynomolgus) infectados e não infectados com HAV, uma amostra humana com hepatite fulminante de etiologia viral por hepatite A e uma amostra humana com hepatite fulminante de etiologia não viral (controle). Os anticorpos primários (IgY) utilizados foram purificados dos ovos dos grupos I e III, e o anticorpo do Grupo V foi utilizado como controle. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Todas as aves imunizadas com antígeno HAV soro-converteram, e os anticorpos IgY anti-HAV foram efetivamente transferidos para a gema dos ovos tendo a associação dos adjuvantes IFA mais CPG-ODN se mostrado mais efetiva. Os métodos de caracterização da IgY demonstraram especificidade ao antígeno HAV, contudo o diagnóstico tecidual pela técnica da IIF apresentou excessiva marcação inespecífica, necessitando de aprimoramento na técnica de purificação da imunoglobulina para uso nesta finalidade.