| dc.description.abstract | As leishmanioses formam um grupo de doenças antropozoonóticas, endêmicas em 88 países e
presentes em quase todos os estados brasileiros. O desenvolvimento de uma vacina contra das
leishmanioses é altamente desejável já que a terapia e as características biológicas e
ecoepidemiólogicas dos parasitos e seus vetores associados não facilitam o controle da
doença. Kinetoplastid Membrane Protein-11 (KMP-11) é uma molécula candidata a vacina
contra as leishmanioses. Utilizando ferramentas in vitro e in silico, foi avaliada a
antigenicidade de 13 peptídeos sintéticos abrangendo a sequência inteira de KMP-11. Para os
estudos in vitro foram usadas células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de
pacientes com leishmaniose cutânea (LC) do estado do Rio de Janeiro. Estas células foram
empregadas para testar a antigenicidade dos 13 peptídeos individualmente e da proteína
integral KMP-11 recombinante, através de ensaios de ELISA e ELISPOT. Na dosagem de
citocinas por ELISA observamos que a proteína KMP-11 recombinante estimulou respostas
de citocinas quase sempre superiores às induzidas pelos peptídeos isolados. No que se refere a
IFN-, dois dos 13 peptídeos (P9 e P10) estimularam níveis desta citocina significativamente
(p<0,05) mais baixos do que os observados com a proteína inteira. Dez peptídeos (P4, P5, P6,
P7, P8, P9, P10, P11, P12 e P13) apresentaram níveis de IL-10 e TNF-α significativamente
inferiores aos observados com a proteína inteira. KMP-11 mostrou-se um potente indutor de IL-10 em PBMC de pacientes com LC, confirmando resultados anteriormente publicados,
mas também foi capaz de induzir a produção de IFN-γ e altos níveis de TNF-α, em níveis
superiores aos dos peptídeos estudados. Na avaliação da razão IFN-γ/IL-10 observou-se um
acentuado contraste entre a maioria dos peptídeos e a proteína KMP-11. As respostas a 11 dos
13 peptídeos mostraram um claro viés de resposta de tipo 1 (IFN-γ>IL-10), a exceção dos
peptídeos P1 e P10 (IFN-γ<IL-10). Na resposta à proteína recombinante KMP-11 houve um
forte predomínio da produção de IL-10 sobre a de IFN-γ. Observou-se uma grande variação
na produção de citocinas estimuladas pelos peptídeos entre os pacientes envolvidos nas
análises. Foi realizado um estudo in silico para predizer quais as sequências de KMP-11 que
teriam maior potencial antigênico através do algoritmo SYFPEITHI, que revelou que os
peptídeos estudados são promíscuos para a maioria dos alelos de HLA de classe I e II
analisados. Para HLA de classe II, P4 mostrou scores significativamente maiores em relação a
todos os outros peptídeos (p<0,05), exceto P10 e P12. Para HLA de classe I os valores de
score para o peptídeo P1 foram significativamente mais altos que os valores dos peptídeos P4,
P10 e P11 (p<0,05). Por outro lado, os valores de score para o peptídeo P11 foram
significativamente mais baixos que os dos peptídeos P1, P2, P5, P6, P12 e P13 (p<0,05). Os
peptídeos P3, P4 e P11 apresentaram valores negativos de score, indicando que eles contêm,
dentro das respectivas sequências, aminoácidos que interferem ou que desfavorecem a
interação e ligação com os diferentes alelos de HLA I. Adicionalmente, foram utilizadas as
ferramentas PAPROC, MAPP e NetChop que possibilitaram predizer que sequências contidas
em P1, P5 e P6 seriam produzidas naturalmente pela maquinaria proteolítica. O algoritmo
PHYRE predisse que KMP-11 apresentava uma conformação de “grampo” com hélices-α
ligadas por uma alça. Adicionalmente este programa predisse a estrutura tridimensional da
proteína. O algoritmo PROTSCALE mostrou que KMP-11 possui três regiões de alta
polaridade entre os aminoácidos 14-29, 34-36 e 44-71. o que estaria relacionado com a
estrutura tridimensional já mencionada. Finalmente, a análise de nível de conservação de
KMP-11 confirmou que esta molécula é bem conservada nos cinetoplastídeos, porém
possibilitou discriminar as sequências dos genes codificadores da proteína no gênero
Leishmania das existentes nos gênero Trypanosoma e Crithidia. Os resultados obtidos na
análise bioinformática estavam, em parte, de acordo com os obtidos na parte experimental
(imunológica) do presente estudo e em estudos anteriores sobre KMP-11. | |
