Amplificação, clonagem, superexpressão e purificação da enzima citidina deaminase (Cdd, E.C.3.5.4.5) de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

The Tuberculosis (TB) is considered a threat to global public health; according to the World Health Organization, nearly two million people die annually due to this disease. One of the most importat features of this pathogen is its ability to persist in host tissues for a long period in a state of latency, also known as persistence. The importance of the state of latency to the bacillus survival has been an attractive factor towards the development of works to characterize in greater detail this phase of infection by M. tuberculosis. An understanding of the mode of action and the role of pyrimidine salvage pathway enzymes in M. tuberculosis could reveal new targets for the rational design of potent and selective anti-TB agents capable of, hopefully, preventing progression and reactivation of the disease. Cytidine deaminase (CDA; EC 3. 5. 4. 5), an evolutionarily conserved enzyme of the pyrimidine salvage pathway, catalyzes the hydrolytic deamination of cytidine and 2’-deoxycytidine to form uridine and 2’-deoxyuridine, respectively. The probable CDA gene (cdd, Rv3315c) from M. tuberculosis H37Rv was cloned, sequenced, and expressed in Escherichia coli BL21(DE3) cells. The purification protocol of recombinant M. tuberculosis CDA (MtCDA) yielded 35 mg of homogeneous protein from 10 g of cells. Mass spectrometry, N-terminal amino acid sequencing, and gel filtration chromatography confirmed the predicted molecular mass, identity, and oligomeric state of MtCDA, which was estimated to be 52. 99 kDa. These results and the ones for multiple sequence alignment suggest that MtCDA is a homotetramer in solution. Steady-state kinetic measurements yielded the following parameters: KM and kcat values of, respectively, 1004 μM and 4. 8 s-1 for cytidine, and 1059 μM and 3. 5 s-1 for 2'-deoxycytidine. The pH dependence of kcat and kcat/KM for cytidine indicates that the protonation of a single ionizable group with pKa value of 4. 3 abolishes activity, and protonation of a group with pKa value of 4. 7 reduces substrate binding. Crystals of CDA were obtained using the hanging-drop vapour-diffusion method. The demonstration that the Rv3315c locus encodes a protein having CDA activity in M. tuberculosis is the first step to understand the role of this gene product and should help the design of anti-TB agents and vaccines.

A tuberculose (TB) é considerada uma ameaça à saúde pública mundial; segundo a Organização Mundial da Saúde, cerca de dois milhões de pessoas morrem anualmente em conseqüência desta doença. Uma das características mais importantes do patógeno causador da TB é a sua capacidade de persistir nos tecidos do hospedeiro por um longo período em um estado de latência, também conhecido como persistência. A importância do estado de latência à sobrevivência do bacilo tem sido um atrativo fator para o desenvolvimento de trabalhos que caracterizem com maior profundidade esta fase da infecção por M. tuberculosis. O entendimento do modo de ação e o papel das enzimas da rota de salvamento de pirimidinas em M. tuberculosis poderia revelar novos alvos para o desenho racional de agentes anti-TB potentes e seletivos capazes de, se possível, prevenir a progressão e a reativação da doença. A citidina deaminase (CDA, EC 3. 5. 4. 5), uma enzima evolutivamente conservada da rota de salvamento das pirimidinas, catalisa a deaminacao hidrolítica de citidina e 2’-desoxicitidina para formar uridina e 2’-desoxiuridina, respectivamente. O provável gene da CDA (cdd, Rv3315c) de M. tuberculosis foi clonado, seqüenciado e expresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). O protocolo de purificação da CDA recombinante de M. tuberculosis (MtCDA) produziu 35 mg de proteína homogênea a partir de 10 g de células. A análise de espectrometria de massas, seqüenciamento N-terminal e cromatografia por gel filtração confirmaram a massa molecular prevista, a identidade e o estado oligomérico de MtCDA, que foi estimada em 52,99 kDA. Estes resultados e os de alinhamento múltiplo de seqüências sugere que MtCDA é um homotetrâmero em solução. Medidas de cinética em estado estacionário da CDA geraram os seguintes parâmetros: valores de KM e kcat de, respectivamente, 1004 μM e 4,8 s-1 para citidina, e 1059 μM e 3,5 s-1 para 2'- desoxicitidina. A dependência dos valores de kcat e kcat/KM em função do pH para citidina indicam que a protonação de um único grupo ionizável com valor de pKa de 4,3 elimina a atividade, e a protonação de um grupo com pKa de 4,7 reduz a ligação ao substrato. Foram obtidos cristais de CDA utilizando o método de difusão de vapor em gota pendente. A demonstração de que o locus Rv3315c codifica uma proteína com atividade CDA em M. tuberculosis é o primeiro passo para entender o papel do produto deste gene e deverá ajudar no desenho de agentes anti-TB e vacinas.