La transgénesis mediada por espermatozoides (SMGT) es una técnica basada en la habilidad intrínseca de las células espermáticas de unir ADN exógeno y poder ser usada para la producción de embriones y animales transgénicos. El objetivo de este estudio fue localizar mediante inmunocitoquímica, la unión del transgén en los espermatozoides porcinos sometidos a diferentes tratamientos (frescos-F, congelados/descongelados-CD y congelación rápida–CR) de tal modo que presentaban diferentes grados de alteración de las membranas. Las muestras de semen fueron incubadas con el plásmido (EGFP 5,4 kb) marcado con digoxigenina (DIG) en medio SFM (1x108 espermatozoides/ mL + 5µg ADN/mL). Se utilizaron anticuerpos anti-DIG marcados con fluoresceína (FITC) para la localización del ADN mediante el microscopio de fluorescencia. Los espermatozoides fueron clasificados en 4 categorías según su localización: 1) región acrosomal, 2) región post-acrosomal, 3) en ambas regiones (acrosomal y post-acrosomal), 4) sin ADN unido. Mediante el microscopio de fluorescencia se observaron diferencias en el porcentaje y el patrón de unión en los espermatozoides sometidos a los diferentes tratamientos. Los espermatozoides sometidos a un proceso de CR presentaron un mayor porcentaje de unión que el semen F (CR: 88,29 ± 2,38% vs. F: 63,46 ± 5,90%, P<0,01), mientras que el grupo de espermatozoides CD presentó valores intermedios (74,00 ± 3,05%). Así, en los espermatozoides F el ADN se une principalmente en la región acrosomal (F: 51,09 ± 7,70%, FT: 17,77 ± 4,49%, CR: 7,76 ± 1,58%, P<0,01). Por otro lado, cuando los espermatozoides CD y CR fueron evaluados, la unión del ADN se localizaba en ambas regiones (F: 40,04 ± 5,88%, CD: 54,82 ± 2,55%, CR: 78,09 ± 1,75%, P<0,01). En conclusión, existe un patrón de distribución diferente del ADN exógeno dependiendo del grado de alteración de las membranas espermáticas.50-56agarcia@um.esBimestralSperm Mediated Gene Transfer (SMGT) is a technique based on the ability of sperm cells to bind exogenous DNA and can be used for the production of transgenic embryos and animals. The aim of this study was the immunolocation of the transgene bound to the spermatozoa after different sperm treatments (fresh-F, frozen-thawed-FT and quick frozen-QF) which induce different degrees of membrane alterations. Sperm samples were incubated with plasmid (EGFP, 5.4 kb) labelled by digoxigenin (DIG) in SFM medium (1x108 sperm/mL + 5µg DNA/mL). Anti-DIG labelled by FITC antibody was used for the localization of the DNA and observed by epifluorescent microscopy. Spermatozoa were classified in 4 categories according to DNA localization in the spermatozoa head: 1) in acrosomal region, 2) in post-acrosomal region, 3) in both regions (acrosomal and post-acrosomal regions), 4) DNA not bound. Using epifluorescent microscopy it was observed differences in the binding pattern after different sperm treatments, so in F sperm the DNAbinding is mainly localized in the acrosomal region (F: 51.09 ± 7.70%, FT: 17.77 ± 4.49%, QF: 7.76 ± 1.58%, P<0.01). On the other hand, when FT or QF spermatozoa were evaluated the DNA-binding tends to be in both regions (F: 40.04 ± 5.88%, FT: 54.82 ± 2.55%, QF: 78.09 ± 1.75%, P<0.01). In conclusion, there is a different exogenous DNA distribution in sperm depending on level of plasma membrane damage.