| dc.description | Colagenases são enzimas proteolíticas de grande interesse industrial. O custo desta enzima
purificada é muito elevado, gerando a necessidade da busca de métodos alternativos de
produção. O trabalho objetivou selecionar uma cepa do gênero Streptomyces produtora de
colagenase extracelular, determinar as melhores condições de cultivo para a produção da
enzima pela cepa selecionada, realizar a caracterização bioquímica parcial das colagenases
produzidas e a purificação parcial das colagenases através do sistema de duas fases aquosa
(SDFA) PEG/fosfato. As cepas foram submetidas ao cultivo líquido sob condições
controladas, analisando a capacidade de degradar gelatina e azocol, para a escolha do melhor
produtor de colagenase. Em seguida foi realizado um planejamento experimental completo 24
para a seleção das melhores condições de produção, onde pH, temperatura, velocidade de
agitação orbital e concentração do substrato foram estudados. Foi realizada a seguir a
caracterização bioquímica da enzima e a purificação parcial das colagenases através do SDFA
PEG/fosfato. Dois planejamentos experimentais completos (24 e 22) foram usados para
escolher as variáveis significativas para o processo de extração, sendo o pH, a massa molar do
PEG, concentração de PEG e concentração de fosfato as variáveis independentes investigadas.
O primeiro SDFA foi composto por, PEG com massa molar de 1500, 4000 e 8000 g / mol
com concentrações de 12,5, 15,0 e 17,5% (w / w), fosfato de concentrações de 10,0, 12,5 e
15,0% (w / w) e pH (6,0, 7,0 e 8,0). O segundo planejamento foi composto por, PEG com
massa molar de 4000, 8000 e 10.000 g / mol com concentrações de 12,5% (w / w), fosfato de
concentrações de 10,0% (w / w) e pH (6,0, 7,0 e 8,0). As respostas avaliadas foram: fator de
purificação, coeficiente de partição e rendimento em atividade da enzima. Dentre as cepas de
Streptomyces estudadas, mais de 97% foram capazes de degradar a gelatina e de utilizar o
azocol como substrato, porém, o Streptomyces sp. DPUA1559 foi considerado o melhor
produtor da colagenase. A máxima produção da enzima foi obtida após 72 h de fermentação,
com atividade colagenolítica de 21,13 U/ml. Através do estudo de produção utilizando
planejamento fatorial foi possível obter um valor da atividade colagenolítica de 39,13 U/ml e
definir as melhores condições de cultivo (100 rpm, pH 6,0 e 1,5% de gelatina a 28°C). A
colagenase apresentou pH ótimo 8,0 e estabilidade na faixa de pH 7,4 a 9,5 durante 5h. Foram
observados dois picos de temperatura ótima que foram em 37°C e 50°C, indicando a presença
de mais de uma enzima as quais foram estáveis na faixa de 25 a 70°C durante 5h. As
colagenases encontradas foram identificadas como serino e aspártico proteases. O zimograma
demonstrou várias bandas com atividade proteolítica: 108, 64, 57, 48, 45 e 43kDa. Os
melhores resultados obtidos a partir do SDFA foram (coeficiente de partição 0,36, o
rendimento de atividade de 167,2% e fator de purificação de 2,53) foram obtidos com o
sistema PEG 8000, pH 8,0, c oncentração de PEG 12,5% (m / m) e concentração de fosfato
de 10,0% (m / m ). Os resultados demonstram o potencial do uso de Streptomyces sp.
DPUA1559 como produtores de colagenases e que o SDFA foi seletivo para extração de
colagenases. | |
