Orientador: Sophie Françoise Mauricette DerchainTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A ascite peritoneal é uma característica distinguível de pacientes com câncer de ovário avançado e é formada em por uma resposta inflamatória ao tumor maligno. A presença de diferentes subtipos de linfócitos tem sido relatada por exercer funções ativadoras ou inibidoras na resposta imune contra o tumor neste microambiente tumoral. Objetivos: Caracterizar o líquido ascítico de pacientes com câncer de ovário em relação aos subtipos de linfócitos, citocinas e atividade funcional das células NK. Descrever as características fenotípicas e moleculares de uma linhagem tumoral de ovário CAISMOV24, estabelecida a partir de uma amostra de ascite carcinomatosa obtida durante o estudo, e comparar as alterações genômicas entre a linhagem e suas células primárias. Metodologia: As ascites foram coletadas por paracentese de alívio guiada por ultrassonografia e o sangue por punção venosa. As amostras foram processadas para obtenção da fração celular e sobrenadante/soro, ao qual foram armazenadas em nitrogênio líquido e a -20oC respectivamente. As amostras de fração celular foram usadas para a fenotipagem dos subtipos de linfócitos, avaliação da expressão dos receptores ativadores das células NK e sua atividade funcional, medida pelo marcador de degranulação CD107a. As amostras de sobrenadante/soro foram usadas para a quantificação de citocinas. Todas as análises foram feitas por citometria de fluxo. A linhagem CAISMOV24 foi estabelecida através de células isoladas da ascite carcinomatosa de uma paciente com câncer de ovário. Foi avaliado o seu potencial de expansão celular, produção de biomarcadores solúveis, expressão de moléculas de superfície e mutações genéticas típicas de carcinoma seroso de ovário. Adicionalmente, foi usada a hibridização genômica comparativa para comparar alterações genômica entre a CAISMOV24 e suas células primárias malignas. Resultados: A degranulação das células NK de ascites não carcinomatosas foi significativamente maior (p<0,05), quando comparadas aos outros grupos, tanto quanto antes e após a estimulação com IL-2, sugerindo uma estimulação local prévia. Entretanto, a estimulação com IL-2 não teve efeito nas células NK de ascites carcinomatosas. A quantia de T-regs e a citocina TNF-? (tumor necrosis factor- ?) foi significativamente maior em ascites carcinomatosas, sugerindo imunomodulação e inflamação relacionada a malignidade do tumor. A linhagem tumoral de ovário CAISMOV24 ficou em cultura por mais de 30 mêses e mais de 100 passagens in vitro. Os marcadores celulares de superfície EpCAM, PVR e CD73 são altamente expressos na CAISMOV24, quando compara as células primárias malignas. CAISMOV24 também produz CA125 e HE4 in vitro. Apesar de a CAISMOV24 apresentar alterações genômicas (28 CNV nas células malignas primárias e 37 CNV nas CAISMOV24), a maioria delas foram similares as alterações observadas nas células primárias malignas. A linhagem CAISMOV24 apresentou mutações KRAS com o tipo selvagem TP53, portanto a linhagem foi categorizada como carcinoma seroso de ovário de baixo grau. Conclusões: A performance funcional das células NK foi distinta entre ascites carcinomatosas e não carcinomatosas. As ascites carcinomatosas apresentaram um microambiente tumoral imunossupressor, com altos níveis de linfócitos T-reg, supressão dos receptores ativadores das células NK e reposta ineficiente das células NK ao estímulo com IL-2, medida através da degranulação. A linhagem CAISMOV24 foi caracterizada como carcinoma seroso de baixo grau, similar às células primárias malignas. Nosso estudo corrobora com o uso da análise de CNVs, observando alterações genômicas para categorizar subtipos de carcinomas de ovárioAbstract: Peritoneal ascites is a distinguishable feature of patients with advanced epithelial ovarian cancer (EOC), and is a result of the inflammatory response triggered by the malignancy. The presence of different lymphocyte subsets has been reported to exert activatory and inhibitory function on the immune response against the tumor in this microenvironment. Objectives: Characterize the ascites liquid from ovarian cancer patients in relation to lymphocyte subtypes, cytokines and functional activation of NK cells. Describe the phenotypic and molecular characteristics of the ovarian cancer cell line CAISMOV24 and compare to the genomic alterations between the cell line and their primary malignant cells. Methodology: Ascites were collected by paracentesis guided by ultrasonography and the blood by venipuncture. The samples were processed to obtain the cell fraction and supernatant/serum, which were stored in liquid nitrogen and -20oC respectively. The cell fraction samples were for the phenotyping of lymphocyte subtypes, evaluation of NK cells activating receptors expression and NK cell functional activity, measured by the degranulation marker CD107a. The supernatant/serum samples were used for the quantification of cytokines. All the analyzes were done by flow cytometry. The CAISMOV24 cell line was established by cells isolated from malignant ascites from a patient with ovarian cancer. It was evaluated its cellular expansion potential, production of soluble biomarkers, expression of surface molecules and genetic mutations typical of ovarian serous carcinoma. Additionally, comparative genomic hybridization was used to compare genomic alterations between CAISMOV24 and its primary malignant cells. Results: NK cells degranulation from EOC cell-free ascites was significantly (p<0,05) higher than all the other groups, either in their resting state or after IL-2 stimulation, suggesting a previous local stimulation. In contrast, the stimulation with IL-2 had no effect on NK cells from ascites with EOC cells. The amount of T-regs and the cytokine TNF-? (tumor necrosis factor-?) was significantly higher in ascites with EOC cells compared to EOC cell-free ascites, suggesting immunomodulation and inflammation related to the tumor malignancy. The CAISMOV24 cell line has been in continuous culture for more than 30 months and more than 100 in vitro passages. The cell surface molecules EpCAM, PVR and CD73 are overexpressed on CAISMOV24 cells compared to the primary malignant cells. CAISMOV24 continued to produce CA125 and HE4 in vitro. Although the cell line had developed alongside the accumaltion of genomic alterations (28 CNV in primary malignant cells and 37 CNV in CAISMOV24), most of them were related to CNVs already present in the primary malignant cells. CAISMOV24 harbored KRAS mutation with wild type TP53, therefore it is characterized as low-grade serous carcinoma. Conclusions: The functional performance of NK cells was distinct between EOC cell-free ascites and ascites with EOC cells. Ascites with EOC cells displayed an immunosuppressive microenvironment, with high levels of T-reg lymphocytes, suppression of NK cells activating receptors and inefficient response to IL-2, measure through degranulation. The cell line CAISMOV24 was characterized as a low-grade serous ovarian carcinoma, similar to its primary malignant cells. Our study corroborates with the idea that genomic alterations, depicted by CNVs, can be used for subtyping ovarian carcinomaDoutoradoFisiopatologia GinecológicaDoutor em Ciências da Saúde2014/07401-3FAPESP