Orientador: Renata de Oliveira Mattos GranerTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Streptococcus mutans (SM) é uma espécie bacteriana comum da cavidade bucal de humanos envolvida na patogênese da cárie dental, a qual pode promover infecções sistêmicas ao atingir e persistir na corrente sanguínea (Nomura et al., 2006). Para persistir nos nichos do hospedeiro, SM utiliza sistemas reguladores transcricionais de dois componentes (SDCs). Os SDCs CovR e VicRK de SM regulam genes de virulência associados à ligação a polissacarídeos extracelulares (PEC) produzidos a partir da sacarose (gbpB, gbpC e epsC) e/ou na interação da parede celular com a matriz de biofilmes (wapE, lysM, 2146c, smaA). A inativação destes SDCs promove resistência à fagocitose por PMN na presença de sangue (Negrini et al.,2012), indicando papel da regulação de funções de escape a opsoninas do sangue, como o sistema complemento. O objetivo deste trabalho foi identificar os mecanismos moleculares através dos quais CovR e VicRK modulam a susceptibilidade de SM à imunidade mediada pelo sistema complemento e a sobrevivência em sangue. Os resultados obtidos foram incluídos em três artigos científicos apresentados em capítulos. No capítulo I, caracterizamos o perfil de susceptibilidade ao complemento na espécie SM. Análises de citometria de fluxo e de RT-PCRq revelaram que cepas isoladas de infecções sistêmicas têm menor susceptibilidade à opsonização pelo complemento e expressão reduzida de covR comparadas a isolados bucais. A inativação de covR em SM UA159 aumentou a resistência à opsonofagocitose por PMN mediada pelo complemento, de forma dependente da ligação a PEC, e aumentou a sobrevivência em sangue humano ex vivo e na corrente sanguínea de ratos. Isolados de sangue mostraram expressão significativamente maior de genes reprimidos por CovR (gbpC e epsC) e a maior ligação a PEC. Consistentemente, a inativação de gbpC e epsC reduziu a ligação a PEC e aumentou a susceptibilidade ao complemento, estabelecendo a função destes genes no escape à opsonofagocitose. No capítulo II, mostramos que VicRK regula a susceptibilidade de SM ao complemento de forma independente de PECs. A inativação de vicK promoveu resistência à opsonização pelo complemento. Análises transcricionais indicaram que VicR reprime a expressão de proteases Smu.399 e PepO e de proteínas enolase e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de superfície (GAPDH), implicadas na virulência de estreptococos. A inativação de smu.399 e pepO aumentou a susceptibilidade ao complemento, revelando papel na virulência. No capítulo III, demonstramos que CovR e VicRK regulam a proteína ligadora de colágeno Cnm, associada com à virulência por mecanismos não completamente conhecidos. Análises transcricionais e de interação entre proteínas recombinantes rVicR e rCovR com a região promotora de cnm demonstraram que CovR e VicR atuam respectivamente, como indutor e repressor de cnm. Os mutantes covR e vicK demonstraram diversos fenótipos compatíveis com as alterações na expressão de cnm. Assim, estabelecemos que os SDCs CovR e VicRK regulam múltiplos fatores de escape à opsonização pelo sistema complemento e/ou na sobrevivência em sangue. Estes resultados contribuem para a definição de alvos terapêuticos para controle das infecções sistêmicas por esta espécieAbstract: Streptococcus mutans (SM) is a common bacterial species of the oral cavity of humans involved in the pathogenesis of dental caries, which can promote systemic infections once reaching and persisting in the bloodstream (Nomura et al., 2006). To persist in the host niches, SM applies two-component transcriptional regulatory systems (TCS). The TCS CovR and VicRK of SM regulate virulence genes associated with SM-binding to extracellular polysaccharides (EPS) produced from sucrose (gpbB, gbpC and epsC) and /or involved in the interaction of the cell wall with the biofilm matrix (wapE, lysM, 2146c, smaA). Inactivation of this TCS promotes resistance to phagocytosis by PMN when in the presence of blood (Negrini et al., 2012), indicating that these systems regulate genes for evasion to blood opsonins, such as the complement system. The aim of this study was to identify the molecular mechanisms through CovR and VicRK modulate the susceptibility of S. mutans to complement mediated immunity and survival in the bloodstream. The results obtained were included in three scientific articles which are presented as chapters. In chapter I, we characterize the profile of SM strains susceptibilities to the complement. Flow cytometry and RT-PCR analysis revealed that strains isolated from systemic infections show lower susceptibility to complement deposition and reduced expression of covR compared to oral isolates. Inactivation of covR in SM UA159 increased resistance to complement mediated opsonophagocytosis by PMN in a way dependent on binding to EPS, ex vivo survival in human blood and in the bloodstream of rats. Blood isolates showed significantly higher expression of CovR-repressed genes (gbpC and epsC) and, consistently, increased binding to EPS. Consistently, inactivation of gbpC or epsC reduced binding to EPS and increased susceptibility to complement. In Chapter II, we show that VicRK regulates SM susceptibility to complement-mediated immunity, in a EPS-independent way. Inactivation of vicK increased resistance to complement opsonization. VicRK was shown to directly or indirectly repress the expression of Smu.399 and PepO complement proteases and the enolase and surface glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) proteins implicated in systemic virulence in other streptococci. Finally, in Chapter III, we established that CovR and VicRK directly regulate the Cnm protein, a which is important for systemic virulence in a sub-set of strains harboring cnm gene. Transcriptional analyses and assessment of interaction of recombinant proteins rCovR and rVicR with the cnm promoter region established that CovR acts as an inducer of cnm, whereas vicR acts as a repressor. Cnm-mediated virulence phenotypes were significantly associated with lower and higher cnm expression in the covR and vicK mutants, respectively. Thus, we showed that the TCSs CovR and VicRK regulate several systemic virulence factors dependent and independent of the interaction with EPS, involved in evasion to complement-mediated immunity and survival in blood. These results further confirm the importance of SM in systemic infections and contribute to the definition of therapeutic targets for controlling these infectionsDoutoradoMicrobiologia e ImunologiaDoutora em Biologia Buco-Dental2015/07237-1FAPESPCAPES