Orientadores: Eneida de Paula, Selma GiorgioDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A Leishmaniose visceral (LV), é uma doença fatal e negligenciada, considerada pela OMS uma das seis doenças endêmicas de maior relevância no mundo. A doença é uma zoonose que tem o cão doméstico como principal reservatório urbano do parasito L. infantum; e a infecção de cães domésticos é denominada Leishmaniose Visceral Canina (LVC). Os cães são considerados alvos estratégicos para o controle da doença. A infecção canina, geralmente, precede o aparecimento de casos humanos e é ainda, mais prevalente que a LV em humanos. No âmbito doméstico, a maioria dos cães com sorologia positiva não apresentam sinais clínicos, mas podem, como reservatórios,infectar os flebotomíneos. LVC é uma doença complexa e com altas taxas de prevalência, chegando a acometer 80 % de toda a população canina nas áreas endêmicas. A maioria dos estudos de candidatos a fármacos e sistemas de tratamentos para LVC foram realizados in vivo, sem condições experimentais controladas. Por isso, justifica-se o uso de linhagem de macrófagos de cão para estudos de toxicidade de fármacos in vitro. Além disso, considerando-se que não existe tratamento que garanta a cura parasitológica da LVC, é preciso desenvolver novas formulações farmacêuticas que ajudem melhorar a eficácia dos fármacos e tratamentos leishmanicidas, aumentando sua atividade e reduzindo a toxicidade. Neste trabalho se objetivou desenvolver, caracterizar e avaliar, um sistema de infecção de macrófagos DH82 com L.infantum (in vitro), uma formulação lipossomal de liberação sustentada para o fármaco leishmanicida antimoniato de meglumina (AME), um dos principais fármacos utilizados no tratamento da LV, com uma nova abordagem terapêutica para o tratamento da LVC. Lipossomas unilamelares grandes (LUV) compostos por fosfatidilcolina de ovo, fosfatidilserina e colesterol (4:0,4:3-razão molar) foram preparados por extrusão, em pH 7.4. A formulação lipossomal foi caracterizada quanto à eficiência de encapsulação do AME (23 %). As formulações foram acompanhadas por 180 dias de armazenamento a 4 ºC, quanto ao tamanho das vesículas polidispersão e potencial zeta. O diâmetro médio dos lipossomas encapsulados foi de 359 +/- 3,1 nm e o potencial zeta mostrou-se bastante negativo (-61,5 mV) pela presença do lipídio (PS) carregado negativamente, na formulação. Os níveis de peroxidação não ultrapassaram 1 % do total de lipídios da formulação. Testes de citotoxicidade in vitro, em culturas de células DH82 revelaram que a AME livre induziu morte celular concentração dependente, com redução de 50 % da viabilidade celular após 96 horas com 0,005 M; efeito diminuído com o AME lipossomal (L-AME), o qual não atingiu 50 % da diminuição da viabilidade celular em nenhuma das concentrações testadas, indicando menor potencial tóxico contra macrófagos para a formulação proposta. Testes de avaliação da atividade leishmanicida, revelaram capacidade do sistema AME lipossomal em diminuir a carga parasitária dos macrófagos de cão em 30 vezes, comparado com o controle de macrófagos infectados mas não tratados, também mostrou uma diminuição de 49 % da carga parasitária em macrófagos infectados quando comparada com o AME livre na sua máxima concentração (0,01 M) após 96 horas de tratamento. Finalmente encontrou-se colocalização e internalização dos lipossomas LUV (marcados com NDB-PE) e o parasito L.infantum-mcherry dentro dos macrófagos DH82 com um número superior às 3000 colocalizações nas 8 h e tratamento o que indica que quanto os lipossomas e o parasita tem o mesmo local de ação ajudando á entender os resultados obtidos nesta pesquisa quanto ao efeito leishmanicida do sistema lipossomalAbstract: Visceral Leishmaniasis (VL) is a fatal and neglected disease, considered, by the WHO, as one of the six endemic diseases with major relevance in the world. It is a zoonosis that have domestics dogs as main urban reservoir for the parasite L. infantum, and the infection in domestic dogs is named as Canine Visceral Leishmaniasis (CVL). Dogs are considered strategic targets for the disease control measures. The canine infection usually precedes the onset of human cases being more prevalent than VL in humans. The most dogs with positive serology do not exhibit clinical signs, but may, as reservoirs, infect sand flies. CVL is a complex disease with high prevalence rates, up to 80 % of the canine population in endemic areas. Most studies of candidates to be drugs and treatments for CVL systems were performed in vivo without any control over the experimental conditions. In consequence, the use of dog macrophage lineages for in vitro drug toxicity studies are necessary. Furthermore, considering that, there is no treatment to guarantee the parasitological cure for CVL, it is necessary to develop pharmaceutical formulations to improve the effectiveness of leishmanicidial drugs and treatments, increasing this activity and reducing toxicity. The aim of this work was to, develop, characterize and to assess a system to treat DH82 macrophage infection with L.infantum (in vitro), a sustained relase liposomal formulation for the meglumine antimoniate (AME), the main drug used in VL treatment, thus, introducing a new therapeutic approach for the treatment of CVL. Large unilamellar lipossomes (LUVs) composed by egg-phosphatidylcholine, phosphatidylserine and cholesterol (4:0.04:3,molar ratio) were prepared by extrusion at pH 7.4. The liposomal formulation was characterized regarding the encapsulation efficiency of AME (23 %). The formulations was followed for 180 days of storage at 4 ºC. The size, polydispersity index and zeta potential of the vesicles were measuared. The mean diameter of encapsulated liposomes was found to be 359 +/- 3.1 nm and the zeta potential was negative (-61.5 mV), by the presence of negatively charged lipid (PS), in the formulation. Peroxidation levels did not exceed 1 % of the total lipids in the formulation. Citotoxicity studies using DH82 cells demonstrated that free AME induced cell death in a concentration dependent manner, showing a reduction of 50 % of cell viability in 96 hours at 0.005 M; the reduced citotixicity of lipossomal-AME (L-AME), (which could not achieve the 50 % reduction of cell viability at any of the concentration tested), revealed lower toxic potential for the proposed formulation in macrophages. The evaluation tests of leishmanicidal activity revealed the ability of L-AME system to decrease the amount/load of parasites in dogs macrophages by 30 times compared to the infected but not treated controlled macrophages and also showed a 49 % decrease of the parasites when compared with free AME treatment in its maximum concentration (0.01 M), after 96 hours of treatment. Finally it was found colocalization and internalization of the liposome LUV (labeled with NBD-PE) and the parasite L.infantum-mcherry within macrophages DH82 with a superior number of 3000 colocalizações at 8 h of treatment indicating that as the liposomes and the parasite has the same site of action, help us to understand the results obtained in this study as the leishmanicide effect of liposomal systemMestradoFármacos, Medicamentos e Insumos para SaúdeMestra em Ciências2014/12443-7FAPESP