Orientador: Erich Vinicius de PaulaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A quebra da barreira endotelial (BE) é considerada um ponto chave na fisiopatologia da sepse, e as vias que participam da regulação fisiológica da integridade da BE são hoje considerados promissores alvos terapêuticos no choque séptico. O objetivo do nosso estudo foi investigar o efeito do soro de pacientes com choque séptico sobre a integridade da BE e explorar o papel do heme extracelular, VEGF-A e angiopoietina-2 (Ang-2) como potenciais mediadores da permeabilidade microvascular no choque séptico em humanos. Métodos: Para isso, soro de pacientes com choque séptico e voluntários saudáveis foram utilizados para estimular monocamadas de células endoteliais (HUVECs). A integridade da BE foi avaliada por meio da detecção de impedância elétrica, que mede a resistência elétrica transendothelial (TEER) de monocamadas de células endoteliais, e através de estudos morfológicos baseados em imunofluorescência das junções célula-célula. Os níveis séricos de mediadores clássicos da quebra da BE, VEGF-A e Ang-2 e os níveis de heme foram medidos nas mesmas amostras. Nós avaliamos também, o efeito do heme na BE utilizando o mesmo modelo experimental do choque séptico. Do ponto de vista de mecanismos, nós avaliamos o efeito do heme sob a internalização e fosforilação da proteína de junção célula-célula, VE-caderina. Resultados: O soro de pacientes com choque séptico (n = 18) causou uma redução mais acentuada do TEER do que o soro de voluntários saudáveis (n = 11), e essas alterações foram associadas a um aumento na extensão das folgas intercelulares. Os níveis séricos de heme no choque séptico foram semelhantes aos descritos na anemia falciforme. Além disso, apenas os níveis de heme correlacionaram-se tanto com a gravidade da sepse quanto com a ruptura do EB. Finalmente, o heme livre foi capaz de induzir um aumento marcado e transitório na permeabilidade de EB medido por ensaios tanto funcionais como morfológicos. Resultados preliminares sugerem uma tendência de aumento do grau de fosforilação e internalização da VE-caderina em células endoteliais estimuladas com heme. Conclusão: Nosso estudo mostrou que o soro de pacientes de choque séptico é suficiente para induzir a ruptura da BE, e que o heme presente no soro desses pacientes em níveis semelhantes aos observados em outras anemias hemolíticas também pode induzir a ruptura transitória da barreira endotelial. Mostramos também que o heme livre pode exercer um papel na internalização e fosforilação da VE-caderina, porém mais estudos serão necessários para confirmar ou refutar esse fato. Estes resultados abrem caminho para a investigação de estratégias terapêuticas destinadas a limitar a disponibilidade de heme extracelular na sepse humanaAbstract: Endothelial barrier (EB) breakdown is regarded as a hallmark of sepsis and pathways that participate in the physiological regulation of EB integrity are emerging as promising targets in septic shock. The aim of our study was to investigate the effect of serum from patients with septic shock on EB integrity, and to explore the role of extracellular heme, VEGF-A and angiopoietin-2 (Ang-2) as potential mediators of microvascular permeability in human septic shock. Methodology: Serum from patients with septic shock and healthy volunteers was used to stimulate HUVEC monolayers. EB integrity was assessed by electric cell-substrate impedance sensing, which measures the transendothelial electrical resistance (TEER) of endothelial cell monolayers, and by immunofluorescence-based morphological studies of cell-cell junctions. Serum levels of classical mediators of EB function, VEGF-A, Ang-2 and heme were measured in the same samples. The effect of heme on EB function was then assessed using the same experimental model. From a mechanism standpoint, we evaluated the effect of heme on the internalization and phosphorylation of the cell-cell junction protein, VE-cadherin. Results: Sera from patients with septic shock (n = 18) induced a more pronounced decrease of TEER than sera from healthy volunteers (n = 11), and these alterations were associated with a increase in the extension of intercellular gaps. Serum levels of heme in septic shock were similar to those described in sickle cell anemia. Moreover, only heme levels correlated with both sepsis severity and with EB disruption. Finally, free heme was capable to induce a marked and transient increase in EB permeability as measured by both functional and morphological assays. Preliminary results showed a trend increasing the level of phosphorylation and internalization of VE-cadherin in heme-stimulated endothelial cells. Conclusion: Our study showed that serum from patients from septic shock is sufficient to induce EB breakdown, and that heme, present in plasma of these patients in levels similar to those observed in other hemolytic anemias can also induce the transient disruption of endothelial barrier. We also showed that free heme may play a role in the internalization and phosphorylation of VE-cadherin, although more data will be required to confirm or refute this fact. These results pave the way for the investigation of therapeutic strategies aimed at limiting the availability of extracellular heme in human sepsisDoutoradoPatologia ClinicaDoutora em Ciências2014/00984-3FAPESPCAPES