Orientadores: Ângela Cristina Malheiros Luzo, Joaquim Murray Bustorff-SilvaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: As fístulas enterocutaneas (FE) são de difícil cicatrização e manejo, associam-se a sepse, desnutrição, distúrbios hidroeletrolíticos, dentre outros. O processo de cicatrização ocorre de maneira coordenada, sendo que fatores de crescimento (VEGF/FGF/TGF-?/PDGF) e citocinas (IL/TNF-?/IFN-?) estão diretamente ligados e apresentam importantes funções nos processos de cicatrização e inflamação. A síntese e degradação da matriz extracelular (MEC) estão ligadas ao reparo de feridas, formação de fibrose crônica, morfogênese e invasão e metástase de tumores. As células-tronco mesenquimais (MSCs) têm alta capacidade proliferativa, podendo se diferenciar em várias linhagens celulares, apresentando ação imunomodulatória e efeito parácrino, podendo melhorar o processo de cicatrização. Em estudo anterior, dissertação de mestrado, foi realizada a caracterização das AT-MSCs na 4ª passagem celular e também a comprovação, através de microscopias, de que as AT-MSCs têm capacidade de aderir a fios de sutura, permanecendo viáveis e proliferando. Estes fios foram utilizados em modelo animal de FE do ceco e promoveram uma melhor e mais eficaz cicatrização, num menor tempo. Já o atual estudo, tem como principal objetivo avaliar e compreender, do ponto de vista histopatológico, como o processo de cicatrização de FE ocorreu em modelo animal idêntico ao estudo anterior, após o tratamento com fios de sutura contendo AT-MSCs aderidas. As AT-MSCs foram obtidas através do procedimento de lipoaspiração estética de tecido adiposo, realizada em indivíduos sadios, após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. O tecido adiposo foi submetido ao processo de digestão com colagenase. Na 4ª passagem foram gotejadas 1x106 AT-MSCs nos fios de sutura de 4-0 poliglactina e logo em seguida foi adicionada a cola de fibrina (20uL Fibrinogênio, 30uL Trombina e 10uL Cloreto de Cálcio) para ajudar na adesão das células nos fios de sutura. O experimento animal utilizou ratos Wistar (25 animais) distribuídos em 3 grupos: Grupo controle (GC ¿ 5 animais), Grupo fístula sem AT-MSCs (GF ¿ 5 animais) e Grupo fístula com AT-MSCs (GF/AT-MSCs ¿ 15 animais). O GC não sofreu nenhum tipo de lesão e foi sacrificado com 21 dias. No GF o fio de sutura utilizado para formar a fístula foi um fio de sutura sem adesão de AT-MSCs, sendo este grupo acompanhado e sacrificado com 21 dias. Já no GF/AT-MSCs o fio de sutura utilizado para formar a fístula continha 1x106 AT-MSCs aderidas. Este grupo foi subdividido em grupos de 7, 14 e 21 dias (5 animais em cada), dias em que os animais foram sacrificados. Essa divisão foi realizada para acompanhar como ocorreu a cicatrização nas diferentes fases deste processo. Após a exposição do ceco foi realizada enterotomia de 5mm, sendo então realizada a sutura da abertura da parede abdominal (superfície interna da pele) com 4 pontos separados com 4-0 poliglactina. A região do ceco do GC e a região onde se encontravam as fístulas dos GF e GF/AT-MSCs foram coletadas e fixadas em Bouin, passando logo em seguida pelas etapas de processamento do material. Algumas lâminas foram coradas com Hematoxilina e Eosina (HE) e outras seguiram o protocolo de imunohistoquímica para os marcadores MMP-2, MMP-9, COL3A1, COL1, VEGF, TLR4, TNF-? e IL-6. Os resultados histopatológicos demonstraram uma melhor recuperação histológica e arquitetônica, muito semelhante ao GC (animais sadios) das fístulas dos animais do GF/AT-MSCs com 21 dias. Nos grupos GF/AT-MSCs 7 e 14 dias o processo inflamatório foi intenso principalmente na região submucosa, com redução no GF/AT-MSCs 21 dias. As análises imunohistoquímicas demonstraram que houve uma troca de colágeno tipo III para tipo I ao longo do processo de cicatrização, com uma imunomarcação moderada para VEGF, denotando presença de neoangiogênese, com redução importante no grupo GF-AT-MSCs 21 dias. O MMP-2 apresentou baixa marcação no GC, com aumento muito significativo no GF/AT-MSCs 7 dias e uma queda gradativa nos grupos GF/AT-MSCs 14 e 21 dias, demonstrando a tentativa de uma remodelação tecidual inicial (7 dias) e uma queda importante quando essa remodelação foi alcançada. Já no grupo GF/AT-MSCs 21 dias encontramos alta marcação da MMP-9, podendo estar relacionada com o aumento da migração celular causada pela modulação das MSCs. Encontramos baixa marcação da IL-6 no GC e moderada nos demais grupos, podendo estar relacionados com o trauma causado pela lesão, mesmo o grupo 21 dias apresentando uma melhor cicatrização e queda de processo inflamatório. Já no TLR4 observamos baixa marcação no GC com aumento gradativo nos grupos GF/AT-MSCs 7, 14 e 21 dias. O aumento da expressão do TLR4 pode estar relacionado com a modulação causada pelas AT-MSCs no intuito de mediar a liberação de PGE2 que sinalizaria para os receptores e prostanóides, aumentando a secreção de IL-10 pelos macrófagos e diminuindo a migração/proliferação de neutrófilos para o local da lesão, resultados estes compatíveis com o histopatológico encontrado. O TNF-? apresentou baixa imunomarcação no GC, com um aumento nos grupos GF/AT-MSCs 7 e 14 dias e uma queda significativa no grupo GF/AT-MSCs 21 dias, corroborando com os resultados histopatológicos do processo inflamatório. Assim, podemos concluir que houve uma melhor cicatrização no GF/AT-MSCs 21 dias, sendo que as AT-MSCs desempenharam um papel imunomodulador importante neste processoAbstract: Digestive fistulas (DF) are difficult to resolve and surgical failure is frequent. They are responsible for electrolyte disturbances, infections, sepsis, skin lesions, gastrointestinal bleeding, intestinal obstruction and malnutrition. The healing process is related to cellular, molecular and biochemical events, acting and working to regenerate the damaged tissue. Stem cells are characterized by the ability to differentiate into different lineages and by their great capacity of proliferation and self-renewal. Recent studies have shown that stem cell therapy could represent a new approach in this area. Besides their great capacity of proliferation and differentiation to other lineages Mesenchymal stromal cells (MSCs) have also immunomodulatory properties, being easily obtained from adipose tissue (AT). In a previous study, we demonstrated that AT- MSCs could be attached into suture filaments. These filaments were used in the treatment of an animal model with enterocutaneous fistula, similar to those of Crohn¿s disease and have provided a better and faster fistula healing with statistical significance. The actual study aimed evaluate what were the mechanisms involved that have lead to this better healing, when suture filaments with attached AT-MSCs were used. Adipose tissue was obtained from healthy patients submitted to stetical lipoaspirate procedures (50mL) which have previously assigned a written informed consent form. Adipose tissue will be submitted to collagenase digestion, the acquired cells were cultured in a specific medium. At the 4th passages, AT-MSCs, 1x106 cells, were fixed in the suture filament (4-0 Poly Vicryl / Poliglactine 910) by adding fibrin glue (20uL Fibrinogen, 30uL Thrombin and 10uL Calcium Chloride). The animal experiment was carried out with Wistar rats (25 animals) which were divided in three groups; control group (CG - 5 animals) where the animals didn¿t suffer any injury and were analyzed in the 21th day; fistula group (FG), where the lesion was performed with suture filaments without stem cells (AT-MSCs) and the fistula group/AT-MSCs where suture filaments with added AT-MSCs were applied being analyzed in the 7th, 14th and 21th days, 5 animals each). The cecal fistula was created by incising the cecum and suturing the opening to the surgical wound subcutaneously with four separate stitches that were carried out with or without 1x106 AT-MSCs attached in the filaments (FG and F-AT-MSCs groups). After the sacrifice the samples were collected and fixed with Bouin. Then, they were processed due to histological slides being carried out. Some slides were stained with Hematoxylin and eosin and others submitted to immunohistochemistry protocols for MMP-2, MMP-9, COL3A1, COL1, VEGF, TLR4, TNF-? e IL-6 marker. The results showed a better architectural and histological healing in the 21th (F-AT-MSCs group). An intense inflammatory process, in the submucosal area was detected in the 7th and 14th days (F-AT-MSCs) that diminished in day 21. Immunohistochemistry results demonstrated that the collagen type III was exchanged to collagen type I improving the healing process. Moreover, a moderate VEGF immunoreactivity was achieved in these areas in the 7th and 14th days showing the presence of neoangiogenesis, with a great reduction on day 21. There was a weak immunoreactivity of MMP-2 in the CG, otherwise, in the F-AT-MSCs group, a great reactivity was detected in the 7th day that gradual decrease in the 14th and 21th days. These finding probably were related to an initial tendency to tissue-remodeling, and have decreased in day 21 due to the end of the process. The MMP-9 results were similar to MMP-2 in the initial phase (7th day) increasing the immunoreactivity up to the day 21. This high reactivity maybe related to a persistent cell migration to this area due to MSCs immunomodulation. The IL-6 results showed also a weak immunoreactivity in the CG, as expected. The other F-AT-MSCs groups demonstrated a moderate IL-6 reactivity, as a result of the acute trauma phase, even in the 21th day, besides the injured area displayed at that time a complete healing with decrease of the inflammatory process. TLR4 results also demonstrated a weak reactivity in the CG increasing gradually in the F-AT-MSCs groups. The TLR4 increase may be due to the MSCs immunomodulation property leading to PGE2 releases that would signaling to E prostanoid receptors increasing secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10 by macrophages, preventing neutrophils from migrating/proliferating into the injured tissue areas. The TNF-? results were weak in the CG, showing at the F-AT-MSCs group a gradual increase in the first 14th days, decreasing in day 21. These data may explain the histological findings which demonstrated a low number of neutrophil with great reduction of inflammatory reaction. The 21th day (F-AT-MSCs group) results demonstrated that AT-MSCs with their immunomodulatory properties were able to induce a better healing and might be useful to repair digestive fistulasDoutoradoFisiopatologia CirúrgicaDoutor em Ciências01-P-3369/2017CAPES