Orientador: Leandro MartínezDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuímicaResumo: O emprego de enzimas em meios orgânicos tem atraído grande interesse acadêmico e industrial. Nesses solventes, as enzimas podem sofrer alterações vantajosas nas suas propriedades, como mudanças na atividade catalítica, seletividade e estabilidade térmica. A protease subtilisina Carlsberg (SC) é uma enzima que apresenta solubilidade e atividade consideráveis em variados solventes orgânicos. Por essa razão, tem sido estudada em meios não-convencionais, como misturas de água e glicerol. O glicerol apresenta importantes efeitos estabilizadores na atividade e estabilidade térmica de proteínas. A compreensão da estrutura e dinâmica da solvatação de enzimas nos meios não-convencionais é importante, e diversas técnicas experimentais têm sido empregadas na sua investigação. A solvatação de SC em misturas de água e glicerol foi estudada por anisotropia de fluorescência resolvida no tempo. Simulações de Dinâmica Molecular permitem a investigação da dinâmica reorientacional do fluoróforo, possibilitando assim a interpretação em nível microscópico dos dados experimentais. Neste trabalho, a solvatação e anisotropia de fluorescência resolvida no tempo de subtilisina Calrsberg foram investigadas usando simulações de dinâmica molecular da proteína em soluções de glicerol em água com diferentes concentrações. Os resultados indicaram a concentração preferencial de moléculas de água na superfície enzimática em quaquer proporção de solução. No entanto, apesar da leve estabilização das ligações de hidrogênio proteína-água e redução da energia livre da água na primeira camada de solvatação, ocorre substancial substituição de água por glicerol na superfície da proteína. A interação glicerol-proteína possivelmente está portanto relacionada com o efeito estabilizador do glicerol. A dinâmica reorientacional do triptofano fluorescente obtida nas simulações não é consistente com os decaimentos de anisotropia experimentais, o que evidencia uma inconsistência entre a estrutura cristalográfica de SC e a estrutura predominante observada em solução. Aqui, sugerimos que esta inconsistência pode ser resolvida se o estudo de fluorescência experimental seleciona conformações do triptofano com dinâmicas reorientacionais rápidas, enquanto que as conformações cristalográficas, de dinâmica lenta, são suprimidas.Abstract: The use of enzymes in organic media has attracted great academic and industrial interest. In these solvents, enzymes can undergo advantageous alterations in their properties, such as changes in catalytic activity, selectivity and thermal stability. The protease subtilisin Calrsberg (SC) is an enzyme that displays considerable solubility and activity in various organic solvents. Because of that, it has been studied in non-conventional media, such as water and glycerol mixtures. Glycerol has important stabilizing effects in protein activity and thermal stability. The comprehension of solvation structure and dynamics of enzymes in non-conventional media is important, and several experimental techniques have been employed in their investigation. The solvation of SC in water and glycerol mixtures was studied through time-resolved fluorescence anisotropy. Molecular Dynamics simulations allow the investigation of the reorientational dynamics of the fluorophore, making it possible the interpretation at the microscopic level of the experimental data. In this work, the solvation and time-resolved fluorescence anisotropy of subtilisin Carlsberg were investigated using molecular dynamics simulations of the protein in solutions of glycerol in water at varying concentrations. The results indicated the preferential concentration of water molecules in the enzymatic surface in any solution concentration. However, despite the slight stabilization of protein-water hydrogen bonds and the reducion of the water free energy in the first solvation shell, there is substantial substitution of water by glycerol in the protein surface. The glycerol-protein interaction are thus possibly related to the stabilizing effect of glycerol. The reorientational dynamics of the fluorescent tryptophan obtained in the simulations is not consistent with the experimental anisotropy decays, which evidence an inconsistency between the crystallographic structure of SC and the predominant structure seen in solution. Here, we suggest that this inconsistency may be solved if the experimental fluorescence study selects only tryptophan conformations with quick dynamics, while the crystallographic conformations, of slow dynamics, are suppressedMestradoFísico-QuímicaMestra em QuímicaCNPQ