Orientador: Edson AntunesTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: A bexiga urinária recebe inervação autonômica simpática e parassimpática, que atuam conjuntamente para a manutenção do ciclo normal da micção; ou seja, para a fase de enchimento e de esvaziamento. O mediador primário para a contração muscular do músculo liso detrusor é a acetilcolina (Ach), sendo suas ações mediadas, principalmente, pelos receptores muscarínicos dos subtipos M2 e M3, cuja densidade é maior no corpo em comparação à base da bexiga. O músculo detrusor também é inervado por fibras NANC nitrérgicas, mas a função do NO neste tecido ainda não está bem definida. Com o objetivo de investigar se a inibição crônica do NO acarreta alterações funcionais, morfológicas e moleculares do músculo liso detrusor isolado da bexiga urinária de rato utilizamos ratos adultos machos WISTAR (200-350 g), tratados cronicamente L-NAME, na dose de 20 mg/rato/dia durante 7, 15 e 30 dias. Avaliamos os seguintes parâmetros: 1) Atividade da sintase de óxido nítrico (NOS) em bexiga urinária; 2) a dosagem de nitrito/nitrato (NOx) plasmáticos; 3) a resposta contrátil aos agentes carbacol (agonista muscarínico), cloreto de potássio (KCl), cloreto de cálcio (CaCl2) e à estimulação elétrica (1-32 Hz, 80 V, 10 segundos) assim como a resposta relaxante a agonistas beta (?)-adrenérgicos; a dosagem de fosfatos de inositol; 5) a determinação dos parâmetros de KD e Bmax, 6) análise histológica quantitativa das camadas do músculo liso detrusor e trígono. Fragmentos do músculo detrusor foram adaptados em câmaras para órgãos isolados, contendo solução de Krebs-Henseleit e, após o período de equilíbrio, realizamos curvas concentração efeito cumulativas ao carbacol (0,001-10 µM), isoproterenol, metaproterenol e BRL- 37-344 (0,0001-100 µM), ao CaCl2 (0,01-100 mM) e KCl (20-200 mM). Nossos dados mostraram que a inibição crônica de NO aumentou a potência (pEC50) ao carbacol nos períodos de 15 e 30 dias de tratamento com L-NAME, sendo esse aumento cinco vezes maior aos trinta dias de tratamento (6.82±0.06) comparando-se com o respectivo grupo controle (6.09±0.02). Não observamos alterações da resposta máxima (Emax). Este aumento da sensibilidade ao agonista muscarínico pode ser explicado, em parte, pelo aumento do acúmulo de fosfato de inositol, que foi seis vezes maior nos ratos tratados com LNAME por 30 dias em comparação ao respectivo grupo controle. Entretanto, nos ensaios de saturação, o número de receptores (Bmax) não se mostrou alterado, porém, observamos que o tratamento com L-NAME aumentou em, aproximadamente, duas vezes o valor da constante de afinidade (KD) aos receptores muscarínicos em relação ao grupo controle. Observamos que a resposta relaxante ao agonista ?3 (BRL 37-344) mostrou-se diminuída nos ratos tratados com L-NAME, sem alterações na reposta ao isoproterenol e metaproterenol. A análise histológica quantitativa da bexiga urinária revelou que a camada muscular do trígono dos ratos tratados com L-NAME estava 28 % mais espessa em relação à do grupo controle, sem alterações na camada do detrusor. Não foram vistas alterações nas contrações mediadas pelo CaCl2 e nem ao KCl em ambos os grupos. A estimulação elétrica (1-32 Hz, 80 V, duração estímulo 10 s) produziu contrações dependentes da frequência em ambos os grupos, sendo que na freqüência de 32 Hz obtivemos a resposta máxima. Entretanto, nos ratos tratados com L-NAME não foram observadas alterações nas amplitudes das contrações em relação ao respectivo grupo controle. A adição do antagonista purinérgico, suramin (100 µM), reduziu as amplitudes das contrações; porém, a resposta do grupo L-NAME não se alterou em relação ao grupo controle. Nossos dados mostram que a inibição crônica de NO levou à redução da resposta relaxante mediada por agonista ?3-adrenérgico e aumento da sensibilidade aos agonistas muscarínicos. As alterações observadas na resposta muscarínica é devido ao aumento do segundo mensageiro. Além disso, aventamos a hipótese que a hipersensibilidade do detrusor a agonistas muscarínicos pelo bloqueio crônico de NO passa ser secundária à hipertrofia do músculo liso trígono (mas não do trígono) e à deficiência do NO em nível de uretra, levando assim a um detrusor hiperativoAbstract: The urinary bladder is innervated by parassimpathetic and sympathetic fibers, which both contribute to the maintenance of the normal micturition cycle: the voiding and filling phase. Acethylcholine (ACh) is the main neurotransmitter responsible for the detrusor smooth muscle contraction, acting mainly at the muscarinic M2 and M3 subtypes. The detrusor smooth muscle is also innervated by the non adrenergic non cholinergic (NANC) nitrergic fibers, although the exactly mechanism of nitric oxide (NO) in this region is not well established. The aim of the present study was to investigated the functional, morphological and biochemical alterations in isolated detrusor smooth muscle after chronic NO inhibition. Male Wistar rats received N - nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) for 7 to 30 days. The following assays were carried out: 1) NO synthase activity; 2) plasma nitrite and nitrate (NOx) measurement; 3) functional assays to muscarinic, b-adrenoceptor agonists, potassium chloride (KCl) calcium chrolide (CaCl2) and electrical field stimulation; 4) Measurements of [3H]-inositol phosphate; 5) [3H]QNB binding assay to determine the dissociation constant (KD) and the maximum specific binding (Bmax) and 6) bladder morphology. Detrusor smooth muscle strips were mounted in organ baths, containing Krebs-Henseliet at 37oC and aerated with 95% O2 and 5% CO2. Each tissue was connected to an isometric transducer. After the stabilization period concentration responses curves to carbacol (0.001-10 µM), isoproterenol, metaproterenol and BRL 37-344 (0.0001-100 µM), KCl (20-200 mM) and CaCl2 (0.01-100 mM) were carried out. Our data showed that chronic NO inhibition has increased the potency values for carbachol after 15 and 30 days of treatment, being this increase 5-fold higher at 30 days (6.82 ± 0.06) when compared to the control group (6.09 ± 0.09). This alterations in the sensitivity for carbachol could be explained, in part, by the 6-fold increase in [3H]-inositol phosphate in bladder from LNAME in comparison with the control group. Although no alterations on the Bmax values were seen, a 2-fold increase in the KD values was observed. At 30 days, detrusor smooth muscle relaxing responses to b3-adrenoceptor agonist BRL 34-377 was significantly reduced by L-NAME, whereas the relaxing responses to isoproterenol and metaproterenol were not modified. The constitutive NO synthase activity was reduced by 86% in bladder at 7-days L-NAME treatment, which was maintained up to 30 days. No morphological alterations in detrusor smooth muscle were found; however in the trigone smooth muscle, L-NAME treatment caused an increase, approximately 28%, in the thickness of the muscular layer. The amplitude of contraction induced by CaCl2 and KCl was not different in L-NAME treated group when compared to the control one. The contraction induced by electrical field stimulation (1-32 Hz, 80 V, 10 sec) was not different between the treated and non treated group; the addition of suramin, a non selective purinergic antagonist, significantly reduced the amplitude of contraction on both groups; however, no difference on the amplitude response between these groups was observed. Long-term NO-deficiency increases rat DSM contractile responses mediated by muscarinic agonist that are accompanied by significant enhancement in KD values for muscarinic receptors and [3H]-inositol phosphate accumulation in bladder. This supersensitivity for muscarinic agonists along with reductions of b3-adrenoceptormediated relaxations indicates that overactive DSM results from chronic NO deficiency. It is plausible to suggest that chronic NO deficiency at the level of trigone (and/or urethra) triggers a persistent contraction leading in turn to a DSM overactiveDoutoradoDoutor em Farmacologia