Orientador: Maria Silvia Viccari GattiTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Rotavírus do grupo A (HuRV-A) são os principais agentes da diarreia aguda em crianças no mundo e responsáveis por altos índices de morbidade e mortalidade. Desde 1980, pesquisas para o desenvolvimento de vacinas eficazes contra a rotavirose vêm sendo desenvolvidas. No Brasil, em 2006, estabeleceu-se a vacinação compulsória com a vacina Rotarix®, com HuRV-A atenuados do genotipo G1P[8], de maior prevalência no mundo. Entretanto, pesquisadores têm relatado o importante papel da proteína não estrutural NSP4 de rotavírus (RV) nas diarreias, por sua ação enterotóxica que leva ao aumento da permeabilidade paracelular quando da infecção. Há também relatos de que as vacinas atuais não teriam uma ação totalmente eficaz anti-rotavírus dado o papel da NSP4 na diarreia. Portanto, estudos são necessários para contribuir na elucidação do mecanismo de ação desta proteína, incluindo a verificação das diferenças na virulência entre os genotipos E1, E2 e E3 da NSP4 de HuRV-A. Assim, o objetivo principal desse trabalho foi investigar se diferentes peptídeos enterotóxicos (aminoácidos 114-135) da NSP4, correspondentes às sequências mais prevalentes dos genotipos E1, E2 e E3, alteram distintamente a permeabilidade paracelular in vitro e levam a quadros de diarreia mais severos em camundongos. Para isto, amostras fecais de HuRV-A genotipadas para diferentes genotipos E da NSP4 foram submetidas a adaptação em cultura celular, para posterior estudo da diferença na capacidade de alteração da permeabilidade paracelular. Em paralelo, a readaptação de cepas de RV padrão, Wa, vacinal Rotateq® e K8, possibilitou a implementação da técnica de hibridização por molecular beacons (MB). A padronização desta técnica pode facilitar a detecção de HuRV-A infecciosos em amostras fecais, evitando passagens sucessivas e a necessidade de visualização de efeito citopático para a definição da adaptação da cepa viral. O sequenciamento do gene da NSP4 de 41 amostras de HuRV-A de origem fecal, coletadas nos anos de 1994, 2006, 2007, 2009 e 2010, evidenciou a relação entre os genotipos G2P[4] e E2, já que 40 amostras apresentaram esta combinação genotípica. A análise aminoacídica das sequências de genotipo E2 confirmou sua variação intragenotípica, principalmente na porção C-terminal da proteína. Após a avaliação da diversidade gênica e aminoacídica da NSP4, peptídeos sintéticos (PEPs) enterotóxicos (aa 114-135) foram analisados quanto a capacidade de alteração da integridade da monocamada de células Caco-2 pela mensuração da resistência elétrica transepitelial (TEER) e utilização do marcador de permeabilidade paracelular FITC-Dextran. Os resultados indicaram que os PEPs não alteram a integridade da monocamada celular e, consequentemente, não contribuiriam para a diarreia por este modo de ação. Em relação a capacidade de indução de diarreia, o PEP3 (genotipo E3) foi o mais virulento, seguido pelos PEP2 (genotipo E2) e PEP1 (genotipo E1). A análise das diferenças aminoacídicas entre os PEPs sugere que características como hidrofobicidade e polaridade dos resíduos, em posições específicas, são importantes para a virulência da NSP4. Os resultados obtidos contribuem para estudos que avaliam a relação entre as alterações aminoacídicas da NSP4 e a indução de diarreiaAbstract: Human rotavirus group A (HuRV-A) are the most important etiological agents of gastroenteritis in children and they are responsible for high morbidity and mortality rates. Since 1980, intensive researches have been performed to develop effective rotavirus (RV) vaccines. In Brazil, during 2006, compulsory vaccination was established with Rotarix® vaccine, containing G1P[8] attenuated HuRV-A, the most prevalent genotype in the world. However, the importance of RV nonstructural protein NSP4 in diarrhea has been recognized because their action as an enterotoxin, causing reduction in the paracellular permeability in infected cells. Besides, current vaccines have not full efficacy considering the importance of NSP4 in diarrhea. New studies are in course to elucidate the mechanisms of action of the NSP4, including the analyses of the virulence between E1, E2 and E3 NSP4 genotypes from HuRV-A. Then, this study aims to investigate the action of enterotoxic NSP4 peptides (residues 114 to 135), corresponding to the most prevalent amino acid sequences of E1, E2 and E3 genotypes, on in vitro paracellular permeability and diarrhea induction in mices. The first goal was the adaptation of clinical faecal specimens of HuRV-A, that are positive to different E genotypes of NSP4, and the readaptation of RV reference strains, to in vitro growth. After, these samples would be analyzed to changes on paracellular permeability. The readaptation of RV reference strains, Rotateq® vaccine and K8 strains, enabled the implementation of molecular beacons (MB) technique. The standardization of MB technique will facilitate the detection of infectious HuRV-A from faecal samples, without successive passages and the observation of cytophatic effects to define the viral adaptation. The NSP4 sequencing of 41 G2P[4] human faecal strains positive to RV, collected in the years 1994, 2006, 2007, 2009 and 2010, showed the linkage between G2P[4] and E2 genotypes, since 40 from 41 strains displayed E2 genotype. A deduced amino acid sequence alignment for E2 genotype confirmed the intragenotypic variation, mainly in the C-terminal region of NSP4. The enterotoxic peptides (PEPs) of NSP4 were analyzed for the ability to alter the cell monolayer integrity. The results showed by transepithelial electrical resistance measures showed that PEPs do not change the monolayer integrity, suggesting that this mechanism do not contribute to diarrhea. For diarrhea induction in mice, PEP3 (E3 genotype) was the most virulent, followed by PEP2 (E2 genotype) and PEP1 (E1 genotype). The analysis of the amino acid variation between the PEP sequences suggests that hydrophobicity and polarity of residues, in specific positions, are important to the NSP4 virulence. These results contribute to studies evaluating which amino acid alterations in NSP4 alter the ability of diarrhea inductionDoutoradoMicrobiologiaDoutora em Genética e Biologia Molecular2011/23865-1FAPESP