Orientador: Maria Isabel Nogueira CanoDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Os telômeros são complexos de DNA e proteínas que protegem os cromossomos eucarióticos da degradação e fusão terminais, garantindo a estabilidade genômica. As seqüências teloméricas são ricas em guaninas e na maioria dos eucariotos terminam em uma protrusão 3' simples fita denominada de "3'G-overhang". As seqüências adjacentes aos telômeros constituem a região subtelomérica, a qual em Leishmania spp., diferentemente de Trypanosoma cruzi, T. brucei e Plasmodium falciparum, não contém genes que codificam antígenos de superfície. Fu & Barker (1998) caracterizaram essa região em diferentes espécies do gênero Leishmania e verificaram que a mesma possui blocos de uma sequência de 100 pb conhecida como "Leishmania Conserved Telomere Associated Sequences" (LCT AS), a qual aparece flanqueada por repetições teloméricas. Há dois blocos de seqüências conservadas (CSBl e CSB2) que fazem parte das LCTAS e que têm diferente organização e número de cópias na região subtelomérica (Fu & Barker, 1998). Devido ao alto grau de conservação das seqüências desses elementos, sugere-se que estes desempenhem função importante no processo de segregação dos cromossomos e que possam conter sítios para ligação de proteínas do complexo telomérico. O intuito principal deste projeto de Mestrado foi estudar a organização genômica de seqüências da região teloméricalsubtelomérica de Leishmania amazonensis. A partir dos resultados dos "Southem blottings" e dos ensaios de cinética de digestão com a exonuclease Bal31 foi possível estimar que os Fragmentos de Restrição Terminais (TRF "Terminal Restriction Fragments") de L. amazonensis possuem aproximadamente 3,3 kb e que o tamanho médio dos telômeros varia de 0,2 a 1,0 kb. Além disso, as hibridizações com as seqüências CSBl e CSB2 das LCTAS revelaram que esses domínios aparecem como blocos de 0,2 a 1,6 kb, flanqueados por sítios HaeIII, e que CSB 1 e CSB2 encontram-se em menor número de cópias em relação à seqüência telomérica. Demonstrou-se também que há sítios HinjI presentes nas regiões subteloméricas da maioria dos cromossomos, assim como sítios AfaI em posição distal e próximos ao término dos cromossomos. Utilizando-se "Southem blotting" não denaturante, estimou-se o tamanho e a seqüência da protrusão "3'G-overhang" dos cromossomos de L. amazonensis. Essa estrutura possui 2: 12 nucleotídeos e difere das outras espécies do gênero Leishmania por apenas três nucleotídeos na extremidade 3' . Para confirmar os resultados acima, realizou-se a hibridização com as seqüências telomérica e subteloméricas dos cromossomos de L. amazonensis separados por PFGE. Os cromossomos foram separados em 25 bandas coradas com brometo de etídeo com pesos moleculares variando de 0,35 2: 3,0 Mb. Todas as bandas hibridizaram com as seqüências telomérica e subtelomérica, indicando que as mesmas são moléculas lineares. Os experimentos de PFGE em segunda dimensão foram usados com o objetivo de se analisar a organização dessas seqüências nos cromossomos e demonstraram que a maioria dos telômeros de L. amazonensis são polimórficos em tamanho. Um modelo hipotético para essa organização foi proposto. Os ensaios de "Electrophoretic Mobility Shift Assay" (EMSA) e "UV cross-linking" foram utilizados para identificar proteínas formadoras de complexos com os elementos subteloméricos conservados e com a repetição telomérica na forma de dupla-fita. Resultados preliminares demonstraram a existência de três complexos DNA-proteína denominados LaCIF para "Leishmania CSB2 Interacting Factor" e LaTAFI-2 para "Leishmania Telomere Associated Factor 1 and 2". Todos os complexos foram formados com proteínas presentes em extratos S1OO e nuclear e com sondas na forma de dupla-fita. Nenhum complexo foi formado quando se utilizou a seqüência CSB 1 como sonda. Os resultados obtidos neste projeto, apesar de preliminares, poderão contribuir para uma maior compreensão sobre a organização estrutural e sobre a composição da cromatina na região teloméricalsubtelomérica de L. amazonensis, o principal agente etiológico da leishmaniose cutânea e cutâneo-difusa no BrasilAbstract: Telomeres are protein-DNA complexes that protect eukaryotic chromosomes from degradation and end fusions, ensuring genomic stability. The telomeric sequences are guanine-rich and in most eukaryotes telomeres end as "3'G-overhangs". The subtelomeric region is adjacent to telomeres and in Leishmania spp., unlike Trypanosoma cruzi, T. brucei and Plasmodium falciparum, does not contain sequences encoding for surface antigens. Fu & Barker (1998) have characterized this region in different species ofthe genus Leishmania and verified that it is formed by blocks of 100 bp sequences named "Leishmania Conserved Telomere Associated Sequences" (LCTAS). LCTAS are flanqued by telomeric repeats and contain two conserved sequence elements, CSB 1 and CSB2, which differ in organization and distribution (Fu & Barker, 1998). Due to the high degree of sequence conservation between CSBl and CSB2 the authors sugested that these subtelomeric domains may play important role in the process of chromosome segregation and that they could harbor binding sites for telomeric proteins. The main goal of this project was to study the genomic organization of telomeric/subtelomeric sequences of Leishmania amazonensis. From the results obtained with Southem blottings and exonuclease Bal31 treatment it was possible to estimate that the length of Terminal Restriction Fragments (TRF) of L. amazonensis is about 3.3 kb and that telomeres range in size from 0.2 to 1.0 kb. Using the same approaches it was also possible to observe that CSB 1 and CSB2 subtelomeric elements are organized as segments of 0.2 to 1.6 kb, flanqued by HaeIlI sites, and that they are present in lower copy number than the telomeric sequence. It was also possible to demonstrated most of Leishmania amazonensis chromosomes contain HinjI and AfaI sites at subtelomeric positions and that AfaI sites are located at a more distal position in relation to the center of the chromosome. Using non-denaturing Southem blotting it was possible to estimate the sequence and size of the 3' G-overhang in L. amazonensis chromosomes. These structures are about _ 12 nucleotides long and differ from other species of Leishmania by only three nucleotides at the 3' end. To confirm the above results, L. amazonensis chromosomes were separated by Pulsed Field Gel Electrophoresis and hibridized with telomeric and subtelomeric sequences. The results showed that, under our standard conditions, all L. amazonensis chromosomes can be separated in a unique gel as 25 ethidium-bromide bands whose molecular weights vary from 0.35 - _ 3.0 Mb. All ofthese bands hybridized with the telomeric and subtelomeric sequences, indicating that they are linear molecules. PFGE in second dimension was used to analyse the organization of these sequences at the chromosome leveI and demonstrated that most of L. amazonensis telomeres are polimorfic in size. A hypothetical model for this organization was proposed. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) and UV cross-linking were used to identify protein forming-complexes with the conserved subtelomeric elements and with the telomeric repeat in double-stranded formo Pre1iminary results demonstrated the existence of three protein-DNA complexes named LaCIF for "Leishmania CSB2 Interacting Factor" and LaTAFI-2 for "Leishmania Telomere Associated Factor 1 and 2". AlI complexes were formed with proteins present in S100 and nuclear extracts and with the oligoprobes in double-stranded form. No complex was formed when the assays were done with CSB 1 as the oligoprobe. The results obtained in the present work, although in part preliminary, will contribute to a better understand of the estructural organization of the chromosome terminus and the composition of the chromatin in the telomeric/subtelomeric region of L. amazonensis, the main ethiologic agent of cutaneous leishmaniasis in BrazilMestradoGenetica de MicroorganismosMestre em Genética e Biologia Molecular