Orientadores: Alessandra Alves de Souza, Marco Aurélio TakitaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) apresentam grande importância na defesa das plantas contra microrganismos pela capacidade de reconhecerem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) em início de infecção e desencadearem respostas de imunidade inata (PTI). A ativação de PTI permite conferir resistência contra uma ampla gama de microrganismos e, assim, a identificação e compreensão do papel das PRRs é de grande relevância em estudos que visam resistência contra patógenos. As espécies de Citrus apresentam elevado interesse comercial, porém seu cultivo tem sido severamente prejudicado devido às inúmeras doenças causadas por fitopatógenos, como por exemplo, a clorose variegada dos citros causada pela bactéria Xylella fastidiosa. Assim, considerando que a maioria das PRRs identificadas em plantas pertence à família de quinases com repetições ricas em leucina (LRR-RLKs), um dos objetivos desse trabalho foi analisar os aspectos evolutivos das LRR-RLKs no genoma de espécies de Citrus de grande importância econômica, Citrus clementina e Citrus sinensis. O alinhamento múltiplo de sequências conservadas de quinase e a reconstrução de árvores filogenéticas estimadas por máxima verossimilhança permitiu identificar 300 e 297 LRR-RLKs nos proteomas preditos de C. clementina e C. sinensis, respectivamente. As LRR-RLKs de ambas as espécies foram classificadas em 16 subgrupos (I a XVI) e a partir de uma análise mais detalhada do subgrupo XII, que inclui os principais PRRs identificados em plantas, foi verificada uma grande expansão e clusterização nos genomas de Citrus, o que demonstra a importância de eventos de duplicação em tandem na evolução das LRR-XII em Citrus. Além das análises in sillico, neste trabalho também foi avaliado o papel do receptor de EF-Tu (EFR) no reconhecimento de X. fastidiosa. Mutantes de Arabidopsis thaliana com EFR silenciado (efr-1) foram inoculados com X. fastidiosa e, a partir de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), foi verificado um aumento significativo da população bacteriana em efr-1 durante todo o experimento, quando comparado com as plantas selvagens (WT). Em 15 dias após inoculação (DAI), foi observada uma população bacteriana quase dez vezes maior nos tecidos das plantas efr-1. Análises por microscopia de fluorescência confirmaram a elevada colonização bacteriana nos tecidos das plantas efr-1. A importância do EFR no reconhecimento de X. fastidiosa foi avaliada também pela superexpressão de AtEFR em plantas hospedeiras de tabaco, as quais apresentam susceptibilidade a X. fastidiosa. Vinte plantas transgênicas foram identificadas por PCR convencional e a expressão do transgene EFR foi confirmada em seis eventos por qRT-PCR. Análises por western blot confirmaram a presença da proteína heteróloga e a maior produção de ROS verificada em presença dos epítopos elf18 de X. fastidiosa, E. coli e Xanthomonas citri subsp. citri indicam ativação de PTI nas plantas transgênicas de tabaco. A redução significativa na incidência de sintomas nas plantas transgênicas inoculadas com X. fastidiosa demonstra que EFR conferiu ao tabaco maior resistência à infecção bacteriana. Os resultados obtidos em Arabidopsis e tabaco indicam que EFR pode ser uma boa estratégia para transformar espécies susceptíveis de Citrus visando resistência contra X. fastidiosa e X. citriAbstract: Pattern recognition receptors (PRRs) are very important in plant defense against microorganisms because they are able to recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) in early infection process triggering innate immune responses (PTI). Activation of PTI confers resistance against a wide range of microorganisms and studies involving the identification and functional role of PRRs are of great importance. Citrus crops have great commercial importance worldwide; however, the productivity has decreased due to several diseases that affect this culture, such as citrus variegated chlorosis, caused by Xylella fastidiosa. Since most identified PRRs in plants belong to the leucine-rich repeat receptor-like kinases family (LRR-RLKs), one of the goals of this study was to analyze the evolutionary aspects of LRR-RLKs in economically important citrus species, Citrus clementina and Citrus sinensis. The multiple alignment of conserved kinase sequences and the reconstruction of phylogenetic trees estimated by maximum-likelihood identified 300 and 297 LRR-RLKs in the predicted proteomes of C. clementina and C. sinensis species, respectively. The LRR-RLKs from both species were classified into 16 sub-groups (I to XVI) and further analysis in the subgroup XII, which includes the main PRRs identified in plants, showed a large expansion and clustering in the Citrus genome, which demonstrates the importance of tandem duplication in the evolution of LRR-XII in Citrus. In addition to the in silico analysis, in this study we also evaluated the role of EF-Tu receptor (EFR) in the recognition of X. fastidiosa. Arabidopsis thaliana efr-1 mutants were inoculated with X. fastidiosa, and using quantitative real-time PCR (qRT-PCR) we verified a significant increase of bacterial population in efr-1, during the time-course of infection, compared to the wild type (WT). At 15 days after inoculation (DAI) the bacterial population was almost ten times more in the efr-1 tissues in relation to WT. Fluorescence microscopy analysis confirmed the high bacterial colonization in the tissues of efr-1 plants. The importance of EFR in X. fastidiosa recognition was also evaluated by the overexpression of AtEFR in tobacco host plants, which are susceptible to X. fastidiosa. Twenty transgenic events were identified by conventional PCR and the expression of the EFR transgene was confirmed in six lines by qRT-PCR. Western blot analysis confirmed the presence of the heterologous protein and the increased ROS production observed in the presence of elf18 epitopes from X. fastidiosa, E. coli and Xanthomonas citri subsp. citri indicate PTI activation in the tobacco transgenic plants. The significant reduction in the incidence of symptoms in transgenic plants inoculated with X. fastidiosa showed that EFR increased the tolerance against the bacteria infection. The results obtained from A. thaliana and tobacco indicate that EFR could be a good strategy to transform Citrus plants aiming X. fastidiosa and X. citri resistanceDoutoradoGenetica Vegetal e MelhoramentoDoutor em Genetica e Biologia Molecular2013/01412-0FAPESP