Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Fernanda Caroline SoardiTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O estudo da relação entre erros no processo de splicing e a ocorrência de doenças se tornou uma questão importante no campo da pesquisa médica. As alterações que afetam o mecanismo de splicing podem ser a causa direta de doença, podem também modificar a gravidade fenotípica, assim como podem estar ligadas a uma maior susceptibilidade de desenvolver doenças. As mutações de splicing, que em muitos casos originam transcritos não funcionais, têm sido identificadas na grande maioria dos genes envolvidos nos distúrbios da diferenciação do sexo em humanos. A presença de alterações ou mutações em alguns destes genes, pode comprometer a biossíntese correta de proteínas essenciais para o desenvolvimento adequado das gônadas ou dos genitais externos. Através da técnica de minigene, foram estudadas mutações presentes em regiões intrônicas, em três genes essenciais para a correta diferenciação sexual humana: SRD5A2, HSD17B3 e CYP21A2 . O objetivo era verificar se alteravam o mecanismo de splicing normal ou criariam sítios alternativos de splicing. Para o gene SRD5A2, foram estudadas duas alterações: c.548-44T>G, próxima à região aceptora de splicing do intron 3; e, a alteração c.278delG, dentro da região doadora de splicing do intron 1. Os minigenes mutante e controle produziram transcritos com splicing normal, splicing alternativo produzindo um transcrito com 112 nucleotídeos deletados e um transcrito com o skipping do exon 4, porém em quantidades diferentes, o que sugere que esta alteração pode causar um desbalanceamento entre os transcritos normalmente produzidos. A mutação c.278delG, por sua vez, fez com que o spliceossomo reconhecesse um sítio 5¿ de splicing alternativo dentro do exon 1 do gene SRD5A2, produzindo um transcrito com a deleção de 38 nucleotídeos. Este transcrito apresenta um códon de parada de síntese proteica prematuro na posição 121. No gene HSD17B3 foi estudada a alteração c.277+2T>G, que se localiza na região doadora de splicing no intron 3. Neste caso o único transcrito observado como resultado do minigene mutante apresentava o skipping do exon 3 do gene HSD17B3. No gene CYP21A2 foram analisadas duas alterações: a primeira alteração é a c.939+5G>A, localizada na região doadora de splicing do intron 7, e a segunda é a c.289+127T>G, no intron 2. De forma semelhante à observada para a alteração c.548-44T>G do gene SRD5A2, tanto os minigenes controles quanto os mutantes produziram os mesmos transcritos, mas em proporções quantitativamente diferentes. Estes resultados indicam que o sistema de minigene foi adequado para o estudo, embora os resultados tenham sido mais conclusivos para as alterações localizadas nas sequências consenso de splicing, isto é para as c.278delG no gene SRD5A2 e c.277+2T>G no gene HSD17B3. Os resultados das demais alterações sugerem que a transcrição dos genes em questão produzam normalmente diferentes transcritos, mas mediante as trocas nucleotídicas, as proporções entres eles se alteram, podendo assim, afetar a função gênica correta em alguma fase crucial do desenvolvimento. Estes achados colaboraram para o esclarecimento e compreensão do fenótipo dos pacientes portadores das mutações aqui descritas, além de propiciar um melhor entendimento dos efeitos biológicos na transcrição de genes quando na presença das mutações intrônicas. Portanto, o estudo de alterações em sítios de splicing através da análise de minigenes torna-se fundamental tanto para o esclarecimento do diagnóstico clínico, como também para uma melhor comprenssão dos efeitos das mutações sobre os mecanismos moleculares de splicingAbstract: The relation between RNA splicing and occurrence of disease in humans has been an important issue in the field of medical research. Nucleotide changes that affect the splicing mechanism can be the direct cause of disease or modulate the phenotypic severity, and also they can be linked to an increase of disease susceptibility. Splicing mutations have been identified in the vast majority of genes responsible for disorders of sex development in humans. The presence of sequence variations in some of these genes may compromise the correct biosynthesis of proteins involved in the normal development of gonads and external genitalia. Using minigene technique, mutations identified in intronic regions of three essential genes for human sexual differentiation have been studied: SRD5A2, HSD17B3 and CYP21A2. The purpose was to verify whether such mutations would abolish the normal mechanism of splicing or would create alternative splice sites. For SRD5A2 gene, two nucleotide changes have been evaluated: c.548-44T>G, located near the acceptor splice site of intron 3; and c.278delG change within intron 1 donor splice site consensus sequence. Both control and mutant minigenes produced transcripts corresponding to a normal splicing and an alternative splicing showing a transcript with the deletion of 112 nucleotides and a transcript with the exon 4 skipping. However, they differed in the amount of each transcript, suggesting that this nucleotide substitution may result in an imbalance of transcripts normally produced. The c.278delG mutation, in turn, favored the spliceosome to recognize a 5' site for an alternative splicing within exon 1 of the SRD5A2 gene yielding a transcript with the deletion of 38 nucleotides. This transcript has a premature stop codon at position 121. The c.277+2T>G nucleotide change in HSD17B3 gene is located at the splicing donor site of intron 3. In this case the only transcript seen as a result of mutant minigene showed the skipping of exon 3 of the HSD17B3 gene. For the CYP21A2 gene, two nucleotide changes were analyzed: the first is the c.939+5 G>A, located in the donor splice site of intron 7, and the second is the c.289+127T>G, which is located in intron 2. Similarly to the observed for c.548-44T>G in SRD5A2 gene, both control and mutant CYP21A2 minigenes showed transcripts that differed only in the amount produced in each construction. The results described here indicate that the chosen minigene system was adequate for the study, although the results have been more conclusive for changes localized in the consensus splicing sequences, i.e. for c.278delG in SRD5A2 gene and c.277+2T>G in HSD17B3 gene. Results for the other changes suggest that gene transcription usually involve the production of different transcripts. Upon changes in the nucleotide sequence the ratio between each transcript may alter affecting the gene function in critical stages of the development. These findings contributed to understand the phenotype of patients bearing the mutations described here, in addition provided a better understanding of the biological effects on gene transcription caused by intronic mutations. Therefore, the study of nucleotide changes in splicing sites by analyzing minigenes is fundamental both to clarify the clinical diagnosis and also for a better comprehension of the effects of mutations on the molecular mechanisms of splicing, extending our understanding of the endocrine regulation in sexual differentiationDoutoradoGenetica Animal e EvoluçãoDoutora em Genética e Biologia Molecular