Orientador: Mário Tyago MurakamiTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A parede celular vegetal é composta por um complexo polissacarídico junto a proteínas estruturais capazes de conter e comprimir todos as organelas citoplasmáticas. Dentre seus componentes estão polímeros tais como a celulose, hemicelulose, pectina e lignina. Para tanto, a natureza usufrui de uma grande diversidade de enzimas especializadas na formação e degradação desses açúcares complexos, as chamadas CAZymes (do inglês, Carbohydrate-Active enZymes) e classificadas em famílias de acordo com sua estrutura primária e enovelamento. As hidrolases glicosídicas (GHs) estão entre as CAZymes mais abundantes, representadas por 135 famílias. Dentre elas, a família GH43, apresenta-se poliespecífica com uma variedade de atividades (ECs), tais como arabinanase (EC 3.2.1.99). Entretanto, são escassos os estudos estruturais a fim de elucidar os mecanismos de degradação e regulação destas enzimas. Seus substratos, as arabinanas, são a segunda pentose mais abundante presente na parede vegetal e tem considerável valor comercial na indústria alimentícia e de degradação da biomassa. Portanto, o presente estudo teve como alvo a caracterização estrutural e bioquímica de duas novas arabinanases, uma endo-?-1,5-L-arabinanase (ARN2) e uma exo-?-1,5-L-arabinanase (ARN3) extraídas da microflora do rúmen bovino e que apresentaram propriedades funcionais únicas em relação as suas homólogas. A resolução das estruturas por cristalografia de raios X revelou o enovelamento canônico da família GH43, 5-fold ?-propeller, com conservação dos resíduos catalíticos que participam de um mecanismo de catálise por inversão do carbono anomérico. Pela caracterização da enzima ARN2, foi possível verificar que sua interface catalítica é extremamente acessível ao solvente e volumosa, explicando assim, sua preferência por substratos ramificados e contrastando com as homólogas de interfaces mais estreitas que permitem principalmente a acomodação de substratos lineares. A enzima ARN3 apresentou, também, características peculiares quanto ao seu mecanismo de ação envolvendo o reconhecimento da extremidade redutora do polímero para liberação de arabinose. Esta região encontra-se parcialmente bloqueada por um longo e divergente loop (R203-A230). Para confirmar o papel desta região no modo de ação da enzima, uma quimera foi desenhada e o longo segmento foi substituto pela sequência SRGEEP, conservada em endo-arabinanases da família. Como predito, a enzima quimérica adquiriu propriedades de uma endo-enzima gerando arabinobiose, majoritariamente. Interessantemente, as análises estruturais permitiram verificar o papel do domínio acessório na estabilização da fenda de ligação ao substrato em enzimas compostas por dois domínios, como ARN2. Em enzimas que compreendem um único domínio, como ARN3, a região é estabilizada por duas cisteínas adjacentes que formam uma ponte dissulfeto. Além disso, foi observado que estas enzimas não possuem um mecanismo regulatório cálcio-dependente, um comportamento inédito na família GH43. Por fim, este trabalho contribuiu coletivamente com novas estratégias para degradação da fração hemicelulósica/péctica da biomassa vegetal e expande o atual conhecimento a respeito da família GH43. Dentro dos elementos pós-textuais desta tese está o artigo I, referente aos resultados obtidos na tese, além dos artigos II e III que consistem de colaborações. No anexo IV consta um breve resumo a respeito dos trabalhos realizados durante o doutorado sanduiche na VTT Technical Research Centre of FinlandAbstract: The plant cell wall is composed by a polysaccharide complex together with structural proteins, which are able to hold and compress all the cytosolic organelles. Among these components, there are polymers such as cellulose, hemicellulose, pectin and lignin. To do so, the nature employs a wide range of specialized enzymes in the synthesis and degradation of these complex sugars, known as CAZymes (Carbohydrate-Active enZymes). Glycosyl hydrolases are among the most abundant CAZymes, represented by 135 families. The GH43 family is a polyspecific group of enzymes and contains a variety of ECs activities, for example that ones with arabinanase activity (EC 3.2.1.99), with application in different industrial fields. However, structural studies in order to elucidate the mechanisms underlying their regulation and mode of operation are still scarce. Their substrates, arabinans, are the second most abundant pentose in the plant cell wall, possessing considerable commercial value in food industry and biomass conversion. Therefore, the present study aimed the structural and biochemical characterization of two novel arabinanases, an endo-?-1,5-L-arabinanase (ARN2) and exo-?-1,5-L-arabinanase (ARN3) retrieved from the bovine rumen microflora and, which presented unique functional properties compared to their homologues. Their structures, solved by X-ray crystallography, revealed a canonical fold of the GH43 family, the 5-fold ?-propeller conserving the classical inversion mechanism that involves two conserved glutamic acid residues. Trough ARN2 characterization, it was possible to verify an extremely solvent accessible and large catalytic interface, explaining its preference to branched substrates and, which contrasts with the narrow interface of homologues that favors the binding of linear substrates. ARN3 also presented unusual features in its mode of action involving the recognition of the reducing end of the substrate and the release of arabinose. This region is found partially blocked by a long and divergent loop (R203-A230). To confirm the role of this region in the mode of action, a chimera was designed and produced and the long segment was substituted by the SRGEEP sequence that is conserved in classical GH43 endo-arabinanases. As predicted, the chimera acquired endo-enzyme properties, generating arabinobiose, mainly, as a final product. Interestingly, structural analyses also allowed to verify the role of the accessory domain in the stabilization of the catalytic cleft in two-domain enzymes such as ARN2. In single domain enzymes, such as ARN3, this region is stabilized by a pair of cysteines forming a disulfide bond. Furthermore, the ruminal enzymes showed a calcium-independent regulatory mechanism, an unheard behavior in the GH43 family. Finally, this work contributed collectively to new strategies to the hemicellulose/pectin degradation and expanded the current knowledge about GH43 family. In the post-text elements, there are the manuscript (I) related to the results presented in this thesis and the articles II and III from collaborative works. The final annex (IV) describes the work developed during the sandwich PhD at VTT Technical Research Centre of FinlandDoutoradoBioquimicaDoutora em Biologia Funcional e Molecular2012/09119-8FAPESP