Dissertação
Avaliação do papel da via FAK/SRC na proliferação e apoptose em linhagem celular JAK2V617F positiva
Autor
Valente, Ana Carolina Menezes Mendonça
Institución
Resumen
Chronic Myeloproliferative Neoplasms (NMPC), which includes Polycythemia
vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Primary Myelofibrosis (PMF), are
clonal disorders characterized by excess of proliferation and apoptosis resistance,
leading to accumulation of myeloid cells. The identification of the acquired JAK2V617F
mutation in patients with PV, ET and PMF allowed a better understanding about this
disease pathogenesis, as the constitutive activation of JAK2 tyrosine kinase plays an
important role in increasing cell proliferation and resistance to apoptosis. However,
there is still no pharmacological treatment that leads all patients to molecular
remission, justifying the study of new molecular targets. In turn, the Focal Adhesion
Kinase (FAK) protein has an important influence on the processes of proliferation,
migration and cell survival and, as it is overexpressed in several neoplasms, it
becomes a promising target in the development of drugs cancer. The present study
proposes to evaluate the role of FAK in the proliferation and apoptosis of SET-2 cells,
a JAK2V617F positive cell line. With this purpose, the following were analyzed: (1)
interaction between FAK and SRC by immunoprecipitation; (2) the effect of the FAK
inhibitor (PF 562,271) on the viability and cell proliferation by MTT; (3) the effect of the
FAK inhibitor on apoptosis induction by evaluating the expression of cleaved PARP
and cleaved Caspase 3 by Western Blotting, (4) the effect of JAK inhibitor (ruxolitinib)
on the expression of p-SRC and SRC. In addition, a RNAseq dataset from SET-2 cells
treated with INC424 (ruxolitinib) for 4h and 48h (GSE 69827), available in "Gene
Expression Omnibus" was analyzed. The differential gene expression and correlation
of PTK2 gene and other 65 genes related to proliferation, survival, apoptosis and
adhesion were performed using the software R studio. The results indicate that the
inhibitor of FAK PF 562,271 significantly reduced in 71.5%, 85.5%, 83.7% and 86.3%
the cell viability at 5uM, 10uM, 25uM and 50uM, respectively. The inhibitor also
induced apoptosis, since there was an increase in the expression of cleaved PARP
and cleaved Caspase 3 after treatment with the inhibitor. The analysis of the RNAseq
database showed that the JAK inhibitor modulated the expression of PTK2 gene and
other genes involved in proliferation, apoptosis and cell adhesion processes.
Regarding the genes related to cell adhesion, the genes PTK2, SRC, PXN, TLN1,
DCC, ITPKC and FLNA showed increased expression and CRK, PTRH2, VCL,
CASS4, ACTB, ZYX, VASP, CTNNB1 and BCAR1 showed decreased expression. In
conclusion, the results indicate that FAK inhibition sensibilizes SET-2 to apoptosis,
reducing cell viability and JAK inhibition with INC424 seems to have influence in PTK2
gene expression and other genes related to focal adhesion pathway. As Neoplasias Mieloproliferativas Crônicas (NMPC) configuram-se como um
grupo de doenças clonais da célula-tronco hematopoética que resultam em acúmulo
das células mieloide. Dentre elas incluem-se a Policitemia vera (PV), a Trombocitemia
essencial (TE) e a Mielofibrose Primária (MF). A identificação da mutação adquirida
JAK2V617F em pacientes com PV, TE e MF permitiu o melhor entendimento da
patogênese dessas doenças, visto que a ativação constitutiva da tirosina quinase
JAK2 tem papel importante no aumento da proliferação celular e resistência à
apoptose. No entanto, ainda não existe um tratamento farmacológico que leve todos
os pacientes à remissão molecular, justificando o estudo de novos alvos moleculares.
Por sua vez, a proteína Quinase de Adesão Focal (FAK), possui importante influência
nos processos de proliferação, migração, sobrevivência celular e apoptose e, por estar
superexpressa em diversas neoplasias, configura-se um alvo promissor no
desenvolvimento de fármacos contra o câncer. O presente estudo propõe avaliar o
papel da proteína FAK na proliferação e apoptose da linhagem celular SET-2, positiva
para a mutação JAK2V617F. Assim, foram analisados: (1) interação entre FAK e SRC
por imunoprecipitação; (2) o efeito do inibidor da FAK (PF 562,271) na viabilidade e
proliferação celular por MTT; (3) efeito do inibidor da FAK na indução da apoptose
avaliando-se a expressão de PARP clivado e Caspase 3 Clivada por Western Blotting;
(4) efeito do inibidor da JAK (ruxolitinibe) na expressão de p-SRC e SRC. Além disso,
um banco de dados de RNAseq da linhagem SET-2 tratada com INC424 (ruxolitinibe)
por 4h e 48h (GSE 69827), disponível no banco de dados público "Gene Expression
Omnibus" foi analisado. A expressão gênica diferencial e a correlação entre a
expressão do gene PTK2 e outros 65 genes envolvidos em proliferação,
sobrevivência, apoptose e adesão foi feita utilizando-se o software R studio. Os
resultados indicam que o inibidor da FAK PF 562,271 reduziu significativamente a
viabilidade celular e a proliferação das células SET-2 a partir da concentração de 5
µM, sendo 71,5%, 85,5%, 83,7% e 86,3% a redução da viabilidade para os
tratamentos com 5 µM,10µM, 25 µM e 50 µM, respectivamente. O inibidor também
induziu apoptose, pois houve aumento na expressão de PARP clivada e Caspase 3
clivada após tratamento. As análises do banco de dados de RNAseq demonstraram
que o inibidor da JAK modulou a expressão do gene PTK2 e de outros genes
envolvidos nos processos de proliferação, apoptose e adesão celular. Com relação
aos genes relacionados com adesão celular, os genes PTK2, SRC, PXN, TLN1, DCC,
ITPKC e FLNA apresentaram aumento da expressão e CRK, PTRH2, VCL, CASS4,
ACTB, ZYX, VASP, CTNNB1 e BCAR1 apresentaram expressão diminuída. Com isso,
os resultados do presente trabalho apontam que a inibição da FAK sensibiliza a
linhagem celular SET-2 a sofrer apoptose, reduzindo assim a viabilidade e o
tratamento com o inibidor da JAK INC424 influencia na expressão do gene PTK2 e de
outros genes relacionados com a via de adesão focal. FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais